___________稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后发育的毒性作用

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2019，50（2）：412-417·412·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com50卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.02.28稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后

发育的毒性作用

黄

涛1，求瑞娟1，兰宗宝2，任逸晨3，杨畅1，钱永靖1，王春丹1，

4*

贺小英1*，司万童1，

014010；2广西农业科学院农业科技信息研究所，南宁

530007；402160）

（1内蒙古科技大学生命科学与技术学院，内蒙古包头

3

包头出入境检验检疫局综合技术服务中心，内蒙古包头014010；4重庆文理学院材料与化工学院，重庆

摘要：【目的】明确稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍（Strauchbuforaddei）胚后发育的毒性作用，为稀土尾矿区两栖类动物的保护提供科学依据。【方法】以内蒙古某尾矿库南侧由渗漏水形成的受污染水域湿地（简称尾矿库湿地）为研究样地、相对未受污染的黄河自然保护区小白河湿地（简称小白河湿地）为对照样地，通过观测分析花背蟾蜍的野外生态学指标、生理生化指标和遗传毒性指标，探究稀土尾矿库渗漏水对花背蟾蜍胚后发育的毒性效应。【结果】尾矿库湿地花背蟾蜍的总数、种群密度、性别比例和抱对率均明显少于小白河湿地花背蟾蜍，但产卵量极显著高于小白河湿地（P<0.01，下同）；尾矿库湿地的蝌蚪发育相对滞后于小白河湿地蝌蚪，但其体格整体上大于小白河湿地蝌蚪。尾矿库湿地蝌蚪肝胰脏中的总抗氧化能力（T-AOC）呈先下降再上升的变化趋势，于III期达最小值；而丙二醛（MDA）含量的变化趋势恰好相反，于III期达最大值。尾矿库湿地各发育期蝌蚪血细胞DNA损伤程度均极显著高于小白河湿地蝌蚪，且血红细胞核异常率明显高于小白河湿地蝌蚪。【结论】尾矿库渗漏水污染通过影响花背蟾蜍的抱对率来降低蝌蚪种群密度，而对其胚后发育的主要影响机理是导致蝌蚪的组织氧化损伤和血细胞DNA损伤。

关键词：花背蟾蜍；尾矿库渗漏水污染；胚后发育；种群密度；DNA损伤；微核率中图分类号：S865.9文献标志码：A文章编号：2095-1191（2019）02-0412-06

ThetoxiceffectsofleakagewaterfromrareearthtailingsreservoironthepostembryonicdevelopmentofStrauchbuforaddei

HUANGTao1，QIURui-juan1，LANZong-bao2，RENYi-chen3，YANGChang1，

4*

QIANYong-jing1，WANGChun-dan1，HEXiao-ying1*，SIWan-tong1，

（1SchoolofLifeScienceandTechnology，InnerMongoliaUniversityofScience&Technology，Baotou，InnerMongolia2

014010，China；AgriculturalScienceandTechnologyInformationInstitute，GuangxiAcademyofAgriculturalSciences，

3

Nanning530007，China；BaotouEntry-exitInspectionandQuarantineBureauComprehensiveTechnicalService

4

Center，Baotou，InnerMongolia014010，China；CollegeofMaterialsandChemicalEngineering，Chongqing

UniversityofArtsandSciences，Chongqing402160，China）Abstract：【Objective】Thetoxiceffectsofleakagewaterfromrareearthtailingsreservoironthepostembryonicde-velopmentofStrauchbuforaddeiwerestudiedinordertoprovidescientificbasisanddatasupportfortheamphibianspro-tectinginthetailingswetland.【Method】Thepollutedwetlandformedbyseepagewaterfromthesouthofatailingsreser-voirinInnerMongoliawastakenasthestudysite（tailingswetlandforshort），therelativelynon-pollutedXiaobaihewet-landinYellowRivernaturalreserveasthecontrolsite（Xiaobaihewetlandforshort），andS.raddeiastheexperimental

animal.Bymeasuringtheecologicalindex，physiologicalandbiochemicalindexandgenetictoxicityindexofS.raddei，thetoxiceffectsofrareearthtailingsleakagewateronthepostembryonicdevelopmentofS.raddeiwerecomparativelyana-lyzed.【Result】Thetotalnumber，populationdensity，sexratioandmatingrateofS.raddeiintailingswetlandweregreat-lylowerthanthoseinXiaobaihewetland，butthespawningamountwasextremelyhigherthanthatinXiaobaihewetland（P<0.01，thesamebelow）.ThedevelopmentoftadpolesintailingswetlandwasrelativelylaggingbehindcomparedwiththoseinXiaobaihewetland，buttheirbodysizeswerelargerthanthoseinXiaobaihewetland.Thetotalantioxidantcapaci-ty（T-AOC）intheliverandpancreasoftailingswetlandtadpolesdecreasedfirstandthenincreased，reachingthemini-mumvalueinstageIII.Onthecontrary，malondialdehyde（MDA）contentsshowedtheoppositetrendandreachedthemaximumvalueinstageIII.TheDNAdamageofbloodcellsoftadpolesineachdevelopmentstageoftailingswetland收稿日期：2018-09-15基金项目：国家自然科学基金项目（31460142）；内蒙古自然科学基金项目（2018MS03067）作者简介：*为通讯作者：贺小英（1978-），博士，副教授，主要从事环境生物学研究工作，E-mail：hxy1124@163.com；司万童

（1986-），博士，副教授，主要从事环境生物学研究工作，E-mail：siwt02@163.com。黄涛（1992-），研究方向为环境生物学，E-mail：niklous0509@163.com

2期黄涛等：稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后发育的毒性作用

·413·wasextremelyhigherthanthoseinXiaobaihewetland，andtherateofredbloodcellnucleusabnormalitywashigherthanthoseinXiaobaihewetland.【Conclusion】Waterleakagepollutionfromtailingspondcanreducethetadpolepopulationdensitybyaffectingthematingrate，andthemaininfluencingmechanismofpollutionontheS.raddeipostembryonicdevelopmentistocauseoxidativedamageoftissuesandDNAdamageofbloodcells.

Keywords：Strauchbuforaddei；waterleakagepollutionoftailingspond；postembryonicdevelopment；populationdensity；DNAdamage；micronucleusrate

0引言

【研究意义】尾矿库是选矿产生的矿渣等废弃物存放地，含有大量的有毒有害物质，而这些物质通过沉降或渗漏等作用，严重破坏尾矿库周边的生态环境（程峰等，2017；司万童等，2017）。两栖类动物是联系水体与陆地环境的重要生物类群，其高渗透性皮肤吸收化学物质的速度是哺乳类动物的100倍Brühletal.，2013），由于这种特定的生理特征和生活史，常作为环境污染尤其是水体和沉积物污染的敏感性指示生物（Sietal.，2014）。因此，开展稀土尾矿库复合污染对两栖类动物的毒性作用研究，可为稀土尾矿库周边区域的污染监测、防控和评价提供参考依据。【前人研究进展】尾矿库渗漏水中含有大量的重金属、盐离子及钍等放射性元素（Huangetal.，2014），可对周边地上及地下区域的土壤和水体造成污染，且这些污染对矿区周边生态环境同样存在潜在负面影响（Sietal.，2014）。司万童等（2013）研究表明，尾矿库渗漏水对植物、水生动物会产生一定的毒性效应，且这种毒性效应与渗漏水污染时间及其浓度存在一定的时间—浓度—效应关系。蝌蚪是蛙和蟾蜍的水生幼体，一般几天内就能发育成一个完整的免疫系统和复杂循环系统，常用于环境监测、抗氧化反应和氧化应激，也可作为污染物暴露的生物指示器（Isnasetal.，2012）。已有研究表明，环境污染对两栖类动物的跳跃能力、骨骼发育、生长发育、抗氧化能力等均会产生一定负面影响（冯磊等，2012；Proki?etal.，2016），生物群体下降、两栖类动物畸形率、死亡率增加也与环境污染密切相关（黄德军等，2004；Sietal.，2014），如重金属污染能改变花背蟾蜍（Strauchbuforaddei）的繁殖对策（Guoetal.，2018；Zhangetal.，2018），影响蟾蜍性腺发育（司万童等，2017），最终导致其种群结构发生改变及种群数量下降。重金属污染还会引起蝌蚪肝脏、肾脏组织的病理变化，且伴有抗有丝分裂活性的作用Monteiroetal.，2018）。因此，通过开展蝌蚪受污染环境的慢性毒性测试可对重要两栖类动物的重金属安全级别进行科学评估。【本研究切入点】花背蟾蜍在黄河流域内蒙古段的活动非常频繁（司万童等，2017），在水生生物食物链中处于非常重要的位置，但至今尚无有关稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后发育毒性作用的研究报道。【拟解决的关键问

题】以内蒙古某尾矿库南侧由渗漏水形成的受污染

水域湿地为研究样地，通过观测分析花背蟾蜍的野外生态学指标、生理生化指标和遗传毒性指标，明确稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后发育的毒性作用，为稀土尾矿区两栖类动物的保护提供科学依据。

1材料与方法

1.1

采样点

研究样地选择内蒙古某尾矿库南侧由渗漏水形成的受污染水域湿地（下简称尾矿库湿地）；对照样地选择相对未受污染的黄河自然保护区小白河湿地（下简称小白河湿地）。尾矿库地势北高南低，渗漏水在尾矿库南侧形成约10万m2的水域湿地；黄河在流经包头市小白河时形成了十几个小型湿地。本研究分别在尾矿库南侧和小白河两地选择地形较规则、采样较容易的样地（约1万m2）作为研究区域图1）。图1研究区域Fig.1Studyregion

1.2

水体和底泥中重金属含量分析分别测定两个样地水体和底泥（0~10cm）中的重金属含量。利用强酸湿法消解对采集的样品进行处理，再以电感耦合等离子体质谱（ICP-MS，德国捷达）测定重金属含量；在重金属元素测定过程中，使用标准品（北京钢研纳克检测技术股份有限公司）绘制标曲和校准设备，保证回收率在（100±10）%。1.3动物样品采集和形态学指标测定

于2017年4月底当地蟾蜍冬眠结束开始活动后，在野外通过背部色斑、婚垫及是否鸣叫等雄性的第二性征辨别雌雄并记录数量，通过实际观察与鸣叫声音相结合的方法对花背蟾蜍数量和种群密度进

（（（·414·南方农业学报50卷行统计。由于蟾蜍的两栖特性，难以获得准确的统计数据，因此蟾蜍数量准确度存在一定的局限性。5月初进入繁殖季节花背蟾蜍开始集中求偶、抱对和产卵，产卵时间一般集中在2~3d内全部完成，之后成体潜回深水区，从此较少现身。卵带一般产在水边浅水区，卵带总数量即代表成功抱对的蟾蜍数量。于花背蟾蜍产完卵的当天在野外观察并统计其产卵量，包括卵带总数和卵带中的卵粒数。此后每天中午12：00定点进行观察统计，直到完全孵化蝌蚪离去后，统计未孵化卵粒数量，计算孵化率。两个样地分别统计10条卵带。产卵后一周左右进入胚后发育阶段，期间共统计4次蝌蚪密度及各发育期蝌蚪比例，每次统计总数约1000只。参照赵振芳（1991）的方法将花背蟾蜍胚后发育分成5个发育期，包括I期（26~27期：胚后发育开始）、II期（30~32期：后肢5个脚趾长出）、III期（35~36期：肛管消失，前脚未出）、IV期（37~38期：前肢出现，尾巴变短）和V期（39期：变态完成，尾巴消失）。各发育期约挑取100只蝌蚪带回实验室，置于干净的培养皿中，然后测量各阶段蝌蚪形态学指标，包括体重、全长、体长、体宽和尾长。全长即自吻端至尾末端的长度；体长即自吻端至尾基部的长度；体宽即体两侧的最大宽度；尾长即自肛管基部至尾末端的长度。试验结束后剩余蝌蚪放生。1.4花背蟾蜍蝌蚪指标分析

蝌蚪血液样品制备及其指标测定：取尾矿库湿地和小白河湿地两个样地的蝌蚪（n>10），放入10mL离心管中断尾采集血样，采用单细胞凝胶电泳技术

（Singlecellgeleletrophoresis，SCGE）检测蝌蚪血

细胞DNA损伤程度，并以血细胞微核率（Micronuc-leus，MN）方法测定蝌蚪血红细胞核异常率。

蝌蚪组织样品制备及其指标测定：采血后的蝌蚪迅速解剖，准确称取肝胰脏组织，按照1∶99比例加入PBS，采用匀浆器迅速匀浆（冰浴），置于50mLEP管中，4℃下3000r/min离心10min。吸取上清液，以南京建成生物工程研究所研发的试剂盒测定总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量。1.5统计分析

利用SPSS17.0进行试验数据统计和单因素方差分析（One-wayANOVA）。

2结果与分析

2.1

花背蟾蜍成体的形体特征及繁殖性能

尾矿库湿地渗漏水常年聚集在南侧，水中污染物不断沉淀于底泥中，致使尾矿库湿地水体和底泥中的各种重金属污染物含量（表1）均显著高于小白河湿地（P<0.05，下同）。在研究样地范围内，尾矿库湿地的花背蟾蜍总数明显少于小白河湿地，对应的花背蟾蜍种群密度也低于小白河湿地（表2）。小白河湿地花背蟾蜍的抱对率显著高于尾矿库湿地，与两样地花背蟾蜍的性别比例有密切关系，小白河湿地花背蟾蜍的雌雄比例为1∶0.94，而尾矿库湿地仅为1∶0.68。在产卵量方面，尾矿库湿地花背蟾蜍的产卵量极显著高于小白河湿地（P<0.01，下同），小白河湿地花背蟾蜍的产卵量仅为尾矿库湿地的

表1小白河湿地和尾矿库湿地的水体及底泥重金属含量比较

Table1TheheavymetalcontentsinwaterandsedimentofXiaobaihewetlandandtailingswetland

重金属HeavymetalAsCdCrCuNiPbZn

水体（μg/L）Water

小白河湿地尾矿库湿地XiaobaihewetlandTailingswetland

0.05±0.005.09±0.34*0.00±0.000.27±0.01*0.05±0.004.85±0.19*0.02±0.004.07±0.28*0.07±0.005.14±0.29*0.01±0.001.07±0.14*0.06±0.00988.60±54.14*

EQSWIII50

550100050501000

底泥（mg/kgDW）Sediment

小白河湿地尾矿库湿地XiaobaihewetlandTailingswetland39.79±2.7590.79±7.64*0.04±0.000.740±0.04*31.33±5.0869.23±2.28*16.95±0.7126.21±0.33*35.42±1.0244.42±0.79*9.28±0.2460.92±6.85*60.99±0.6378.78±3.03*

EQSSII20

135010060350300

EQSWIII：地表水环境质量标准（III级）（GB3838—2002）；EQSSII：土壤环境质量标准（II级）（GB15618—1995）。*表示两样地间差异显著（P<0.05）。表4同EQSWIII：EnvironmentalQualityStandardsforSurfaceWater（IIIgrade）（GB3838—2002）；EQSSII：EnvironmentalQualityStandardforSoils（IIgrade）（GB15618—1995）.*indicatedsignificantdifferencebetweenthetwosites.ThesamewasappliedinTable4

表2小白河湿地和尾矿库湿地的花背蟾蜍数量、形体特征及繁殖性能比较Table2TheS.raddeiamount，morphologicalcharacters，andreproductiveindexesinXiaobaihewetlandandtailingswetland

样地Site

尾矿库湿地Tailingwetland小白河湿地

Xiaobaihewetland

性别数量体长（mm/只）体重（g/只）抱对率（%）产卵量（粒）孵化率（%）SexQuantityLength（mm/S.raddei）Weight（g/S.raddei）MatingrateSpawningamount（egg）Hatchingrate♀4770.50±3.20**26.59±2.52**79.35*5298±803**96.88±0.85♂6966.00±2.17**25.48±2.10**♀18665.74±3.5722.35±1.8694.674421±59597.90±0.73♂19859.75±1.9218.97±0.95

*和**表示两样地间差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）

*indicatedsignificantdifferencebetweenthetwosites（P<0.05），and**indicatedextremelysignificantdifference（P<0.01）