菌落总数
一、依据： GB 4789.2—2010
二、目的：食品中菌落总数的测定 三、设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1 恒温培养箱：（36 ±1） ℃ 2 恒温水浴箱：（46 ±1）℃。 3 天平：感量为 0.1 g、振荡器。
4 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 5 无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL、无菌培养皿：直径 90 mm。 6 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 7 放大镜或/和菌落计数器。 四、 培养基和试剂
1 平板计数琼脂培养基 2 磷酸盐缓冲液 3 无菌生理盐水 五、检验步骤
1 称取 25 g 样品置盛有 225 mL 生理盐水的无菌捣碎机杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。
2 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无 菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合 均匀，制成 1:100 的样品匀液。
3 按 5.2 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管或吸 头。
4 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液在进行 10 倍递增稀释时，吸 取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个 无菌平皿内作空白对照。
5 及时将 15 mL～20 mL 冷却至 46 ℃的平板计数琼脂培养基 （46 ±1）℃倾注平皿，并转动平皿使其 混合均匀。
6 待琼脂凝固后，将平板翻转，（36±1）℃培养 48 h±2 h。 六、菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落 形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
七、结果与报告
1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘 以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。
2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算：
N= ∑C/ (n1+n2)d
3 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
4 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 若所有5 平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
6 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
7 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。
大肠菌群计数（平板计数法）
一、依据： GB 4789.3—2010 二、目的：食品中大肠菌群的计数
三、设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：（36±1） ℃。 3.2 恒温水浴箱：（46±1） ℃。 3.3 天平：感量 0.1 g、振荡器
3.4 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 3.5 无菌锥形瓶：容量 500 mL、无菌培养皿：直径 90 mm。 3.6 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 3.7 菌落计数器。 四、 培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤 4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤 4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA） 4.4 磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水
4.5 无菌 1 mol/L 氢氧化钠（ NaOH）、无菌 1 mol/L 氯化氢（ HCl）。 五、检验步骤
5.1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min,制成 1:10 的样品匀液。
5.1.2 样品匀液的 pH 值应在 6.5～7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。 5.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌 吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
5.1.4 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。 六、 平板计数
6.1 选取 2 个～3 个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种 2 个无菌平皿，每皿 1 mL。同时取 1 mL 生理盐 水加入无菌平皿作空白对照。
6.2 及时将 15 mL～20 mL 冷至 46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心 旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加 3 mL～4 mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平 板，置于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。
6.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在 15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。
6.4 证实试验
从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃ 培养 24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 6.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以 6.3 中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每 g （mL）样品中大肠菌群数。例：10 -4 样品稀释液 1 mL，在 VRBA 平板上有 100 个典型和可疑菌落，挑 取其中 10 个接种 BGLB 肉汤管，证实有 6 个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10 4 /g （mL）=6.0×10 CFU/g（mL）。
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食品中蛋白质的测定（分光光度法）
一、依据： GB 5009.5—2010 二、目的：食品中蛋白质的测定 三、设备和材料 1 设备：
1.1 分光光度计。
1.2 电热恒温水浴锅：（100 ± 0.5） ℃。 1.3 10 mL 具塞玻璃比色管。 1.4 天平：感量为 1mg。 2 试剂：
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的三级水。
2.1 硫酸铜（CuSO 4 ·5H 2 O）、硫酸钾（K 2 SO 4 ）、硫酸（H 2 SO 4 密度为 1.84 g/L）、氢氧化钠 （NaOH）、
对硝基苯酚（C 6 H 5 NO 3 ）、乙酸钠（CH 3 COONa·3H 2 O）、无水乙酸钠（CH 3 COONa）、 乙酸（CH 3 COOH）、37%甲醛（HCHO）、乙酰丙酮（C 5 H 8 O 2 ） 2.2 溶液：
2.2.1 氢氧化钠溶液（300 g/L）：称取 30 g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至 100 mL。
2.2.2 对硝基苯酚指示剂溶液（1 g/L）：称取 0.1 g 对硝基苯酚指示剂溶于 20 mL 95%乙醇中，加水稀 释至 100 mL。
2.2.3 乙酸溶液（1 mol/L）：量取 5.8 mL 乙酸（10.8），加水稀释至 100 mL。
2.2.4 乙酸钠溶液（1 mol/L）：称取 41 g 无水乙酸钠（10.7）或 68 g 乙酸钠（10.6），加水溶解后并 稀释至 500 mL。
2.2.5 乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取 60 mL 乙酸钠溶液（10.14）与 40 mL 乙酸溶液（10.13）混合，该 溶液 pH 4.8。
2.2.6 显色剂：15 mL 甲醛（10.9）与 7.8 mL 乙酰丙酮（10.10）混合，加水稀释至 100 mL，剧烈振 摇混匀（室温下放置稳定 3d）。
2.2.7 氨氮标准储备溶液（以氮计）（1.0 g/L）：称取 105 ℃干燥 2 h 的硫酸铵 0.4720 g 加水溶解后 移于 100 mL 容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于 1.0 mg 氮。
2.2.8 氨氮标准使用溶液（0.1 g/L）：用移液管吸取 10.00 mL 氨氮标准储备液（10.17）于 100ml 容量 瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于 0.1mg 氮。 四、分析步骤
4.1 试样消解
称取经粉碎混匀的固体试样 0.1 g～0.5 g（精确至 0.001 g），移入干燥的 100 mL 或 250 mL 定氮瓶 中，加入 0.1 g 硫酸铜、1 g 硫酸钾及 5 mL 硫酸（10.3），摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以 45° 角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内 液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入 20 mL 水，放冷后移 入 50 mL 或 100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。 按同一方法做试剂空白试验。
4.2 试样溶液的制备
吸取 2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于 50 mL 或 100 mL 容量瓶内，加 1 滴～2 滴对 硝基苯酚指示剂溶液（10.12），摇匀后滴加氢氧化钠溶液（10.11）中和至黄色，再滴加乙酸溶液
（10.13）至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。 4.3 标准曲线的绘制
吸取 0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和 1.00 mL 氨氮标准使 用溶液（相当于 0.00 μg、5.00 μg、10.0 μg 、20.0 μg、40.0 μg、60.0 μg、80.0 μg 和 100.0 μg 氮），分 别置于 10 mL 比色管中。加 4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液（10.15）及 4.0 mL 显色剂（10.16），加水稀 释至刻度，混匀。置于 100 ℃水浴中加热 15 min。取出用水冷却至室温后，移入 1 cm 比色杯内，以零 管为参比，于波长 400 nm 处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。
4.4 试样测定
吸取 0.50 mL～2.00 mL（约相当于氮＜100 μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于 10 mL 比
色管中。以下按 12.3 自“加 4 mL 乙酸钠-乙酸缓酸溶液（pH 4.8）及 4 mL 显色剂……”起操作。试 样
吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。 4.5 分析结果的表述
肉制品检验作业指导书
