实验目的: 实验材料:
1、 碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、浓硫酸、Tween-20 、BSA等。
2、 酶标抗小鼠IgG 3、 TMB 溶液配制:
1、抗原包被液:PH9.6的碳酸盐缓冲液(0.05 M) 批号:
称取:
Na2CO3(分子量105.99) 1.59 g NaHCO3(分子量84.01) 2.9 g
加蒸馏水至1000ml,调PH值。滤膜(0.45 μm)过滤,4℃保存。 2、洗涤缓冲液(PBS-T) 批号: PBS缓冲液 1000 ml Tween-20: 0.5 ml
调PH值至7.39。滤膜(0.45 μm)过滤,室温保存或4℃保存。 3、封闭液(1.0% BSA/PBS-T) 批号:
洗涤缓冲液 1000 ml BSA: 10 g 现用现配。
4、血清稀释液(pH7.4 PBS):0.0067 M(PO4+)
5、洗涤用PBS (pH7.4), 0.15 M(PO4+) 批号: 称取:
NaCl 8.0 g Na2HPO4·12H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g KCl 0.2 g
加蒸馏水至1000 ml, 调PH值至7.39。滤膜(0.45 μm)过滤,室温或4℃保存。
6、二抗稀释液:同洗涤缓冲液
7、终止液:2M H2SO4 批号:
水 90ml 浓硫酸 10.64ml
浓硫酸逐滴加入水中,不断搅拌,防止局部过热。4℃保存。 实验器材:
1、1 ml枪头;200 μl枪头;10 μl枪头,。
2、1.5 ml EP管。
3、移液器1 ml、200 μl、100 μl、20 μl、10 μl、2 μl。 4、96孔板(costor,美国)。 5、电子天枰。
6、酶标仪(Labsystems DragonMK3,芬兰)。 7、洗板机(BIORAD MODEL 1575,美国)。 8、电子pH计(SevenEasy S20)。
方法步骤:
1 包被抗原:
用 μg/ml 的 蛋白包被,每孔100μl。密封,4℃过夜。 2 洗板:
取出预先4℃包被过夜的96孔板,用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次,每次轻轻振荡,拍干。 3 封闭:
每孔加入封闭液300 μl/孔。封膜,37℃放置1 h。 5 洗板:
用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次,每次轻轻振荡,拍干。 6 加一抗:
96孔板上血清稀释倍数为1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400,1:12800,共8个稀释梯度,具体操作如下: 血清在Ep管中稀释成100倍:
1: 10 : 5 μl原倍血清 + 45 μl血清稀释液; 1: 100 : 30 μl 10 倍血清+ 270 μl血清稀释液;
按设计加入96孔板相应位置,然后依次按倍比稀释至200倍、400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍:
1: 400 : 100 μl 200 倍血清+ 100 μl血清稀释液; 1: 800 : 100 μl 400 倍血清+ 100 μl血清稀释液; 1: 1600 : 100 μl 800 倍血清+ 100 μl血清稀释液; 1: 3200 : 100 μl 1600倍血清+ 100 μl血清稀释液; 1: 6400 : 100 μl 3200倍血清+ 100 μl血清稀释液; 1: 12800 : 100 μl 6400倍血清+ 100 μl血清稀释液; 所有样本加完后,封膜,37℃放置1 h。 7 洗板:
用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次,每次轻轻振荡,拍干。 8 加酶标二抗:
酶标抗小鼠IgG稀释5000倍:
稀释过的酶标二抗液100 μl/孔,封膜,37℃放置1 h。
9 洗板:
用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次,每次轻轻振荡,拍干。 10 底物显色:
底物显色液TMB直接使用,注意避光放置。100 μl/孔,37℃避光放置,约10-20分钟。
11 终止反应:
终止液2 M H2SO4 ,100 μl/孔。 12 测OD值:
5 min内在酶标仪上震荡后读数,检测波长450 nm。
elisa检测抗体效价
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