《基因工程原理》中国农业科学院研究生院复习题

由天下分享时间：2024/9/8 21:13:23 加入收藏我要投稿点赞

中国农业科学院究生院《基因工程原理》复习题

1. 20世纪70年代诞生基因工程的理论基础和技术基础是什么？答：理论基础：

①在40年代确定了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；

②在50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题；

③在50年代末和60年代相继提出了中心法则和操纵子学说，成功地破译遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

技术基础：

①用核酸内切限制酶和DNA连接酶进行DNA分子的体外切割与连接技术； ②克隆载体构建技术；

③大肠杆菌转化体系的建立；

④DNA分子的核苷酸序列分析技术； ⑤核酸杂交技术；

⑥琼脂糖凝胶电泳技术。

2. 何为DNA克隆？其主要的实验步骤。

答：DNA克隆又称基因克隆，是指将外源基因插入到克隆载体上形成重组DNA分

子群体，并转化到寄主细胞中进行复制，以便于分离纯化目的基因或特定的DNA片段的实验操作。主要步骤：

①从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；

②体外将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择标记的载体分子上，形成重组子DNA分子； ③将重组子DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖； ④从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆； ⑤从这些筛选出的受体细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；

⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

3. 说明mRNA差别显示分离产物未知基因的基本原理并评述其优缺点。答：原理：

①几乎所有的真核基因mRNA分子的3′-末端都有一段poly(A)尾巴。因

此，在RNA聚合酶作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝；

②根据mRNA分子3′-端序列结构分析，在这段poly(A)序列起点碱基之

前的两个碱基，除了倒二位的碱基为A的情况之外，只能有12种可能的排列组合；

③根据上述mRNA分子结构特征设计的，用以反转录mRNA合成第一链

cDNA的下游引物，共12种，其通式为：5′-T11MN或5′-T12MN。每一种此类人工合成的3′-端锚定引物，都能够把总mRNA群体的1/12分子

反转录成mRNA-cDNA杂种分子。因此，用5′-T11MN引物或5′-T12MN引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等的位序列结构不同的12个分亚群体。

④由于3′-端锚定引物合成的第一链cDNA群体中，代表某一特定细胞类型或发育阶段的mRNA种的含量是相当低的，所以要把一种只在某一发育阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要进行PCR扩增，因此在DDRT-PCR反应中还需5′-端随机引物。

优点：

①可以同时比较多个样品间基因表达的差异； ②可以同时检测到“上游”及“下游”基因；

③检测的灵敏度高，所需样品少，一些低丰度的mRNA亦可被检测出来； ④结合使用PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本法更加简单方便。缺点：

①假阳性比较高，通常可高达50%-70%； ②扩增条带的分子长度比较短小； ③工作量大。

4. 一种基因产生多种蛋白质的原因分析。答：主要原因：

①许多基因都有多个启动子。在真核断裂基因的转录过程中，可变启

动子的使用常涉及到位于转录起点的可变首位外显子，每个可变首位外显子都具有一个专有的启动子，可变首位外显子的不同导致翻译出的蛋白质也不同。

②初级转录本的可变剪接。真核断裂基因的初级转录本，在不同类型

的细胞或不同发育阶段的细胞中会发生不同形式的剪接作用，生成具有不同序列结构特征、编码不同蛋白质异形体的成熟mRNA分子。

次要原因：

③RNA的编辑。RNA的编辑具有多种不同的效应，比如产生新的起始密

码子、终止密码子或多肽链编码序列出现变化，因此改变了源自基因DNA模板链的遗传信息，翻译出不同的蛋白质多肽。

④基因重排。基因区段的转位作用或随机连接会造成基因可变区固有

排列顺序的改变或DNA重排，可使基因产生不同的蛋白质。

5. 影响酶切反应的因素及产生酶切星号活性的分析答：影响因素：

①DNA分子的性质: a. 酶切位点周围的碱基成分；

b. 酶切位点的密度； c. DNA分子的构型；

d. DNA分子的甲基化程度；

②酶切的温度； ③DNA制剂的纯度。

产生酶切星号活性的分析：

①酶用量与DNA样品的比值过高；

②甘油浓度过高；

③二价金属离子的变更；

④金属离子浓度过低； ⑤较高的pH值； ⑥有机溶剂的污染。

6. DNA转录与复制有哪些差别？

答：①对引物的需求有别：转录不需要引物，而复制需要一对上下游引物。

②所用底物不同：转录需要核糖核苷三磷酸：ATP、GTP、UTP和CTP，而复制需要脱氧核糖核苷三磷酸：dATP、dGTP、dTTP、dCTP

③模板的结合状态有异：转录产物RNA要从模板上解离出来，而复制产物DNA始终与模板结合。

④保真程度相差悬殊：转录产物错误率远高于复制产物。 ⑤涉及的范围不同：转录只涉及一个基因或操纵子，而复制则涉及全部基因组。 7. 分别叙述原核基因组和真核基因组的结构特点。答：①原核基因组的结构特点：

（A）高效的遗传信息利用率：

a. 既没有不必要的额外重复序列，也极少存在无功能的冗余序列； b. 基因组９８％以上的核苷酸序列都是编码基因

c. 基因排列紧凑，同一个操纵子不同基因之间的间隔距离一般不超

过 20bp，而且其中还存在着转录起始信号和终止信号； d. 存在着编码序列彼此重叠、编码不同蛋白质的重叠基因。（B）双链ＤＮＡ的编码功能；

（C）多基因聚集排列成操纵子结构形式；

（D）染色体基因组的拷贝数平均每细胞为1.1条，在富裕培养基中可高

达3～4条。

②真核基因组的结构特点：

（A）包装成特定的染色体结构；（B）基因组的多倍性；（C）具有大量的重复序列；

（D）高比例的非编码的DNA序列，以人为例，非编码序列占基因组总长的

98%以上，而蛋白质编码基因的序列还不到基因组总长的2%。包括基因与基因之间的非编码的DNA序列，以及基因内部的非编码的DNA序列。

（E）庞大的基因数量；（F）基因分布密度不均一。

8. 何为柯斯质粒载体，其结构、特点是什么？

答: 定义：柯斯质粒载体是人工构建带有λ噬菌体的cos位点和E.coli质粒的

复制子的新型质粒载体。它具有质粒载体的特点和λ噬菌体的特点。

结构：a. 具一个质粒的复制起点（ori）;

b.具若干来自质粒载体的选择记（1-2个）;

c.具相当数量的来自质粒的核酸内切酶的单切点; d.具有λ噬菌体的cos位点。

特点：①具有λ噬菌体的特点：a.导入寄主细胞后，可以重新环化起来；

b.经体外包装后转导效率大大提高;

c.无法进入溶菌周期，也不能形成噬菌体颗粒。

②具质粒载体特点：a.在寄主细胞内可像质粒DNA一样复制；

b.在氯霉素作用下扩增； c.具有抗生素抗性记号。

③具有高容量的克隆能力：上限45kb，下限30kb； ④能与带有同源序列的质粒DNA重组。

9. 简述构建cDNA克隆的定义、主要步骤及其优越性？

答：定义：cDNA克隆：从mRNA出发，经反转录、与载体分子重组、转化寄主细

胞增殖，将目的基因克隆化的过程称为cDNA克隆。从理论上讲该生物的每一种mRNA都应有一个克隆。故亦称cDNA文库

步骤：

①提取处于特定发育阶段的真核生物体的特定器官或组织中的总RNA，根据mRNA poly(A)尾特点过Oligo(dT)柱，分离纯化出mRNA；

②利用适当引物(一般用Oligo(dT)和反转录酶，获得 cDNA/mRNA杂合分

子。

③用碱处理降解，或用RNaseH酶切割cDNA/mRNA杂合分子中的mRNA

链获得cDNA第一链，再由第一链cDNA合成第二链cDNA。

④双链DNA与适当的载体重组，将重组体的群体导入大肠杆菌寄主细胞

中增殖，从而构成cDNA文库。

优越性：a.以mRNA材料出发，对于RNA病毒特别适用；

b.库容量小（相当DNA文库的15％）筛选工作量小； c.假阳性比例小，因每一种mRNA就应有一个克隆； d.能用于研究分析发育过程中基因的时空表达差异。 10. 表达载体的组成：

答：①原核启动子，最好是诱导型的强启动子，使外源基因蛋白表达量占总蛋白

的10-30%，如果表达的是毒蛋白，启动子应呈现低限的基础转录水平； ②多克隆位点(MCS)，用于插入外源基因； ③抗生素抗性基因，用作选择标记；

④复制起点(ori)，决定外源基因的拷贝数;

⑤转录终止子，防止启动子通读作用，提高蛋白质的稳定性； ⑥翻译起始序列和转译增强子；

⑦翻译终止子，防止核糖体的跳跃(Skipping)。采用四联核苷酸UAAU 效果

更好。

11. 酵母双杂交体系的原理及其用途是什么？

答：原理: 如同许多真核生物的转录因子一样，酵母β-半乳糖苷酶的转录因子

GAL4也含有两个结构上可分开的、功能上相互独立的结构域，即DNA结合域(DNA_BD)和转录激活域(AD)。应用DNA重组技术，可以把GAL4转录因子的这两个结构域分开。如果把它们放置在同一个酵母细胞中，所产生的GAL4 DNA-BD和AD多肽，彼此之间不会直接发生相互作用，所以不具有转录因子的功能活性，无法激活相关基因转录，。但是应用DNA重组技术，将两个分开的GAL4的 DNA-BD和AD，甚至分别来自两个不同的转录因子的DNA-BD和AD重组成一个转录因子(使之在空间上彼此靠近)则又可重新获得转录因子的功能活性，即可激活相关基因的转录。酵母双杂交体系就是根据这种原理建立的。酵母双杂交体系包括两种大肠杆菌-酵母菌的穿梭载体（DNA-BD质粒载体和AD质粒载体）；和一种特殊的己经缺失了内源GAL4转录因子的酵母寄主菌株。

用途：酵母双杂交体系简称Y2H，是在转录因子结构的基础上发展出来的一

种敏感的体内鉴定基因的方法。可用来有效地分离与己知靶蛋白相互作的另一种蛋白质编码基因，也是分离与某种特定启动子调控元件结合的特异性转录因子的有效手段。酵母双杂交体系还可以用于产物未知基因的分离、也可用于新基因功能的鉴定。

12. 用于克隆真核基因的大肠杆菌表达体系的优点和条件答：优点：

①背景知识清楚，分子生物学、遗传学的基础研究，特别是表达调控知识丰富； ②有完善安全的基因工程体系，包括安全的寄主菌株和载体系统；

③早期转基因表达调控研究扎实，许多基因如胰岛素基因、生长素基因等，都

能在大肠杆菌中高效地有效表达；

④易工业化批量生产，培养方便、操作简单、成本低廉，特别是对药用蛋白发

酵生产。条件：

①真核基因的编码序列必须是连续的cDNA，因为原核细胞中不具备剪辑加工

的酶；

②原核的启动子，最好是诱导型的强启动子； ③以融合蛋白质的形式表达，稳定性好。

13. DNA标签法分离产物未知基因的原理及主要步骤答：原理：