过氧化氢对蜕膜化小鼠子宫内膜基质细胞的影响
覃金春，蒋凌云，靳玉甫，覃爱平
【摘 要】[摘要] 目的 植入前的胚胎对氧化应激敏感，低氧状态可能更有利于胚胎的生长及发育。文中旨在探讨过氧化氢(H2O2)对蜕膜化小鼠子宫内膜基质细胞(ESCs)的影响，构建蜕膜化小鼠ESCs氧化应激模型。 方法 采用酶解联合筛网过滤及差时贴壁方法分离培养原代小鼠ESCs。实验分为4组(n=8)：空白对照组为含基础培养液的小鼠子宫内膜基质细胞(ESCs)；蜕膜化组：基础培养液中加入10 nmol/L E2、1 μmol/L P4体外诱导小鼠ESCs蜕膜化72 h；阴性对照组：小鼠ESCs蜕膜化诱导成功后，仅予基础培养液干预4 h；氧化应激组：小鼠ESCs蜕膜化诱导成功后，分别加入含50、100、150、200、250、300 μmol/L H2O2的基础培养液继续干预4 h。免疫组化法检测Vimentin、Cytokeratin表达鉴定原代小鼠ESCs，RT-PCR检测dPRP mRNA的表达鉴定ESCs蜕膜化，CCK-8法检测H2O2干预后细胞生长和增殖活性，流式细胞仪检测细胞内ROS水平判断氧化应激程度。 结果 成功分离、培养和鉴定原代小鼠ESCs。镜下观察细胞呈梭形和多角形、放射状排列；细胞免疫荧光染色检测结果表明Vimentin表达(+)、Cytokeratin(-)，原代小鼠ESCS纯度达(96.3±0.49)%。10 nmol/L E2、1 μmol/L P4作用下，蜕膜化组蜕膜化标志物dPRP mRNA显著高于空白对照组(1.001 0±0.001 1 vs 0.000 2±0.000 0，P<0.01)。与阴性对照组抑制率[(1.000±0.000)%]比较,氧化应激组在H2O2浓度为50、100、150、200、250、300 μmol/L作用下抑制率[(0.013±0.004、0.032±0.007
、0.069±0.023、0.172±0.007、0.395±0.018
、
0.706±0.013)%]，其中150、200、250、300 μmol/L H2O2与阴性对照组
比较差异有统计学意义(P<0.05)。进一步评估50、100 μmol/L H2O2干预后测得的细胞内氧化应激组ROS明显高于阴性对照组(27.77±4.20 vs 17.47±0.61，43.57±6.58 vs 17.47±0.61，P=0.001)。 结论 50、100 μmol/L H2O2不影响蜕膜化小鼠ESCs的生长、增殖，且随H2O2浓度增加，刺激细胞内ROS的产生增多，100 μmol/L H2O2可作为蜕膜化小鼠ESCs氧化应激模型建立的合适刺激浓度。 【期刊名称】医学研究生学报 【年(卷),期】2017(030)002 【总页数】5
【关键词】[关键词] 氧化应激;过氧化氢;蜕膜化;子宫内膜 论 著 (基础研究)
0 引 言
子宫内膜容受性指子宫内膜接受胚胎的能力，是影响胚胎植入的关键因素之一。在人和啮齿类动物中，存在一个短暂的特定时期，即“着床窗口期”，此期子宫内膜容受性最敏感，可接纳胚泡，使其完成定位、黏附、植入的过程；此后子宫内膜不再接受胚胎植入[1]。子宫内膜容受性建立机制极其复杂，不仅受母体全身和局部的激素、免疫系统和各种因子表达水平的调控，而且与局部胚胎、子宫间复杂的信息交流、细胞分化/发育状态有关[2]。
在诸多影响胚胎植入的因素中，氧化应激备受关注。植入前的胚胎对氧化应激敏感，低氧状态可能更有利于胚胎的生长及发育[3]。然而，怀孕期间由于血管适应性变化可引起母胎屏障的氧浓度大范围波动[4]；同时母体子宫由于炎症、
强烈的组织重塑以及局部灌注的改变产生大量的活性氧，若超过机体的抗氧化防御能力可引起氧化损伤[5]。尽管多个研究已证实氧化应激可改变卵母细胞的质量降低受精率，影响胚胎的质量，减少不孕治疗成功的机会[6-8]，但是氧化应激对子宫内膜容受性的损伤作用尚不十分清楚。
为此，本研究以过氧化氢(H2O2)为氧化应激诱导剂，构建体外蜕膜化小鼠胚胎干细胞氧化应激诱导模型，为后续研究硫酸脱氢表雄酮对子宫内膜容受性的影响奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康清洁级中国昆明小白鼠，8～12周龄，25～30 g，32只。由广西医科大学动物实验中心提供,动物合格证号：SCXK 桂 2014-0003。在温度(24±2)℃、湿度(55±15)%、12 h明暗交替条件下饲养。按雌雄2∶1合笼，次晨发现阴栓者为妊娠第1天。1.1.2 试剂 雌激素、孕激素、H2O2(Sigma公司)；I型胶原酶、Dispase酶(Gibco公司)；鼠抗Vimentin抗体、Cytokeratin抗体(Abcam公司)及羊抗鼠荧光二抗(LI-COR公司)；DAPI(Roche公司)；DMEM/Ham′s F-12(杭州吉诺生物医药技术有限公司)；碳吸附血清(Bioind公司)；青/链霉素、CCK-8(碧云天生物技术有限公司)；PCR试剂盒(TaKaRa公司)；ROS检测试剂(Life technologies公司)。 1.2 方法
1.2.1 小鼠ESCs的分离培养 在Frolova分离法的基础上进行改良获取小鼠ESCs[9]。取妊娠第4天(D4)小鼠，处死后消毒皮肤，剪开腹壁，收集子宫，剔除多余脂肪，纵行剖开子宫，将子宫剪成2～3 mm3，用含100 U/mL青霉
过氧化氢对蜕膜化小鼠子宫内膜基质细胞的影响
