YAP及P-YAP在RAW264.7细胞脓毒症模型中的表达*
左文 王海清 钟武 胡迎春 陈睦虎
【摘 要】【摘要】 目的 探讨YAP及P-YAP在RAW264.7细胞脓毒症模型中的表达。方法 将对数生长期的RAW264.7细胞用内毒素(LPS)刺激RAW264.7细胞构建细胞脓毒症模型为实验组,未处理者为正常组。运用免疫荧光对YAP及P-YAP进行定位,Western blot检测YAP及P-YAP的表达情况。结果 实验组YAP蛋白表达于胞核中,而P-YAP表达于胞质中。实验组YAP蛋白表达明显高于正常组(P<0.05),P-YAP蛋白表达明显低于正常组(P<0.05)。结论 细胞脓毒症模型中YAP的高表达及P-YAP的低表达可能参与了脓毒症的发生。 【期刊名称】西部医学 【年(卷),期】2018(030)004 【总页数】4
【关键词】【关键词】 YAP;P-YAP;RAW264.7细胞;脓毒症 ·论著·
脓毒症是机体对感染的过度免疫反应,大量的炎症介质释放到外周血引起全身炎症反应(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)[1]。其发生率占住院患者的1%~2%,如果伴感染性休克和多器官功能障碍,其死亡率高达30%~60%[2]。脓毒症的发生机制尚不明确,若能找到调控脓毒症的关键信号通路及其关键基因,或许能为临床治疗脓毒症提供新靶点。目前关于hippo信号通路在脓毒症中的作用机制的报道较少。Yes相关蛋白(YAP)是hippo信号通路中重要的核心转录因子,参与细胞的增殖、分化及组织的稳定[3]。本实验拟通过检测YAP和P-YAP在细胞脓毒症模型中的表达情况,以探讨YAP和P-
YAP与脓毒症发生的相关性。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器 高糖DMEM培养基(Hyclone),胎牛血清FBS(PAN),LPS(Sigma),YAP、P-YAP及IONS(abcom)一抗,β-actin一抗(碧云天),山羊抗兔IgG二抗(博奥森),绿色荧光山羊抗兔IgG(Protientech),DAPI(索莱宝),蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(Roche),蛋白裂解液(碧云天)。低温离心机(Thermo),生物安全柜(Telstar),荧光显微镜(olympus),共聚焦显微镜(feica),细胞培养箱(Thermo)。
1.2 细胞株 小鼠巨噬细胞RAW264.7,购自中国科学院上海细胞库。
1.3 细胞培养及模型的建立 RAW264.7细胞用含10?S DMEM培养基在5%CO2,37℃条件下培养[4]。取对数期RAW264.7细胞,用100ng/ml的LPS刺激4小时,构建脓毒症模型[5]。取对数期raw264.7细胞在6孔板中培养,每孔接种5.0×106个/ml,分为正常组和实验组,实验组接种24小时后(即对数期)用100ng/ml的LPS刺激4小时建立脓毒症模型,对照组加入相同体积的完全培养基。
1.4 免疫荧光对YAP及P-YAP进行定位 取对数期的RAW264.7细胞在12孔板中爬片,每孔接种2.0×106个/ml,培养24小时后用LPS(100ng/ml)刺激RAW264.7细胞,培养4小时,PBS洗涤3次,每次3分钟,4%多聚甲醛固定15分钟,再用PBS洗涤3次,每次3分钟,0.5%Triton-10打孔20分钟,PBS洗涤3次,每次3分钟,10%山羊血清封闭30分钟,一抗过夜。第二天37℃复温45分钟,吸进一抗后,PBS洗涤3次,每次3分钟,37℃孵育二抗1小时,PBS洗涤3次,每次3分钟,DAPI复染核5分钟,PBS洗涤3次,
每次5分钟,加入适量的抗荧光淬灭剂。然后在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。
1.5 Weston blot检测YAP及P-YAP的表达情况 用含有1%磷酸酶抑制剂和1%蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取蛋白,BCA检测蛋白浓度,用10%的分离胶电泳,先用60V电压电泳30分钟,再用120V电压电泳60分钟,然后转移到PVDF膜,用0.02A恒流转60分钟。用5%脱脂牛奶封闭1小时,PBST洗涤5分钟,YAP(1:4000),P-YAP(1:2000)一抗在4℃过夜。第二天,PBST洗涤3次,每次10分钟,孵二抗(1:4000)一小时, PBST洗涤3次,每次10分钟。用VisionCapt曝光。用Quantity One进行灰度值检测。
1.6 统计学分析 运用SPSS16.0对YAP及P-YAP表达情况进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RAW264.7细胞鉴定及细胞脓毒症模型的建立 INOS为M1型巨噬细胞特异性分子[6],用100ng/ml LSP刺激RAW264.7细胞4h,用免疫荧光检测模型的建立,100%细胞均有INOS表达,见图1。说明RAW264.7浓毒血症模型建立成功。
2.2 免疫荧光对RAW264.7细胞浓度血症模型中YAP及P-YAP进行表达定位 在RAW264.7细胞脓毒症模型中,P-YAP表达于胞质中,在实验组中荧光亮度减弱,见图2。YAP蛋白表达于胞核中,在实验组中荧光强度增强,见图3。 2.3 用Weston blot检测正常组及模型组YAP蛋白及P-YAP蛋白的情况 实验组YAP蛋白表达明显高于正常组(P<0.5),见图4;实验组P-YAP蛋白表达明显低于正常组(P<0.5),见图5。
YAP及P-YAP在RAW264.7细胞脓毒症模型中的表达
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