YAP及P-YAP在RAW264.7细胞脓毒症模型中的表达

YAP及P-YAP在RAW264.7细胞脓毒症模型中的表达*

左文 王海清 钟武 胡迎春 陈睦虎

【摘 要】【摘要】 目的 探讨YAP及P-YAP在RAW264.7细胞脓毒症模型中的表达。方法 将对数生长期的RAW264.7细胞用内毒素(LPS)刺激RAW264.7细胞构建细胞脓毒症模型为实验组，未处理者为正常组。运用免疫荧光对YAP及P-YAP进行定位，Western blot检测YAP及P-YAP的表达情况。结果 实验组YAP蛋白表达于胞核中，而P-YAP表达于胞质中。实验组YAP蛋白表达明显高于正常组(P<0.05)，P-YAP蛋白表达明显低于正常组(P<0.05)。结论 细胞脓毒症模型中YAP的高表达及P-YAP的低表达可能参与了脓毒症的发生。 【期刊名称】西部医学 【年(卷),期】2018(030)004 【总页数】4

【关键词】【关键词】 YAP；P-YAP；RAW264.7细胞；脓毒症 ·论著·

脓毒症是机体对感染的过度免疫反应，大量的炎症介质释放到外周血引起全身炎症反应(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)[1]。其发生率占住院患者的1%～2%，如果伴感染性休克和多器官功能障碍，其死亡率高达30%～60%[2]。脓毒症的发生机制尚不明确，若能找到调控脓毒症的关键信号通路及其关键基因，或许能为临床治疗脓毒症提供新靶点。目前关于hippo信号通路在脓毒症中的作用机制的报道较少。Yes相关蛋白(YAP)是hippo信号通路中重要的核心转录因子，参与细胞的增殖、分化及组织的稳定[3]。本实验拟通过检测YAP和P-YAP在细胞脓毒症模型中的表达情况，以探讨YAP和P-

YAP与脓毒症发生的相关性。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 高糖DMEM培养基(Hyclone)，胎牛血清FBS(PAN),LPS(Sigma),YAP、P-YAP及IONS(abcom)一抗，β-actin一抗(碧云天)，山羊抗兔IgG二抗(博奥森)，绿色荧光山羊抗兔IgG(Protientech)，DAPI(索莱宝)，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(Roche)，蛋白裂解液(碧云天)。低温离心机(Thermo),生物安全柜(Telstar)，荧光显微镜(olympus)，共聚焦显微镜(feica),细胞培养箱(Thermo)。

1.2 细胞株 小鼠巨噬细胞RAW264.7，购自中国科学院上海细胞库。

1.3 细胞培养及模型的建立 RAW264.7细胞用含10?S DMEM培养基在5%CO2,37℃条件下培养[4]。取对数期RAW264.7细胞，用100ng/ml的LPS刺激4小时，构建脓毒症模型[5]。取对数期raw264.7细胞在6孔板中培养，每孔接种5.0×106个/ml，分为正常组和实验组，实验组接种24小时后(即对数期)用100ng/ml的LPS刺激4小时建立脓毒症模型，对照组加入相同体积的完全培养基。

1.4 免疫荧光对YAP及P-YAP进行定位 取对数期的RAW264.7细胞在12孔板中爬片，每孔接种2.0×106个/ml，培养24小时后用LPS(100ng/ml)刺激RAW264.7细胞，培养4小时，PBS洗涤3次，每次3分钟，4%多聚甲醛固定15分钟，再用PBS洗涤3次，每次3分钟，0.5%Triton-10打孔20分钟，PBS洗涤3次，每次3分钟，10%山羊血清封闭30分钟，一抗过夜。第二天37℃复温45分钟，吸进一抗后，PBS洗涤3次，每次3分钟，37℃孵育二抗1小时，PBS洗涤3次，每次3分钟，DAPI复染核5分钟，PBS洗涤3次，

每次5分钟，加入适量的抗荧光淬灭剂。然后在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。

1.5 Weston blot检测YAP及P-YAP的表达情况 用含有1%磷酸酶抑制剂和1%蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取蛋白,BCA检测蛋白浓度，用10%的分离胶电泳，先用60V电压电泳30分钟，再用120V电压电泳60分钟，然后转移到PVDF膜，用0.02A恒流转60分钟。用5%脱脂牛奶封闭1小时，PBST洗涤5分钟，YAP(1:4000)，P-YAP(1:2000)一抗在4℃过夜。第二天，PBST洗涤3次，每次10分钟，孵二抗(1:4000)一小时， PBST洗涤3次，每次10分钟。用VisionCapt曝光。用Quantity One进行灰度值检测。

1.6 统计学分析 运用SPSS16.0对YAP及P-YAP表达情况进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAW264.7细胞鉴定及细胞脓毒症模型的建立 INOS为M1型巨噬细胞特异性分子[6],用100ng/ml LSP刺激RAW264.7细胞4h，用免疫荧光检测模型的建立，100%细胞均有INOS表达，见图1。说明RAW264.7浓毒血症模型建立成功。

2.2 免疫荧光对RAW264.7细胞浓度血症模型中YAP及P-YAP进行表达定位 在RAW264.7细胞脓毒症模型中，P-YAP表达于胞质中，在实验组中荧光亮度减弱，见图2。YAP蛋白表达于胞核中，在实验组中荧光强度增强，见图3。 2.3 用Weston blot检测正常组及模型组YAP蛋白及P-YAP蛋白的情况 实验组YAP蛋白表达明显高于正常组(P<0.5),见图4；实验组P-YAP蛋白表达明显低于正常组(P<0.5)，见图5。