流式细胞仪操作规程目录
１:淋巴细胞亚群测定及绝对计数
２:活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T得检测 3:HLA-B２7测定 4:CD55／CD5９测定 5:干细胞检测与绝对计数 ６:白血病免疫分型测定
7:淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFＮ—γ/IL－４测定 8:细胞周期分析 ９:活化血小板检测 １０:血小板抗体测定 11:红细胞抗体测定 １2:粒细胞抗体测定
淋巴细胞亚群测定
(流式细胞仪) 医院检验科 操作规程文件号: 200 年 月 日起实施
第1版 (共3页)
本规程每
2年复审一次
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淋巴细胞亚群测定
方法 流式细胞仪(ＢｅｃkｍanCoｕlter,贝克曼库尔特) 原理: 双/三色／四色直接免疫荧光法。荧光素标记得各种单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应得抗原结合,经过溶血、洗涤(与固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,从而得到淋巴细胞亚群得百分数,加入Ｆｌｏw—Coｕnｔ即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下:T淋巴细胞:CD3+;B淋巴细胞:ＣD３—,ＣDｌ9＋;辅助性T淋巴细胞:CD3＋ＣＤ４+;抑制性T淋巴细胞:CＤ3＋CD8＋;NＫ细胞:ＣD3—CDｌ6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达得不同,流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同得亚群,利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群得百分数,加入Ｆlow—Coｕｎt组会自动得出绝对计数。 标本采集与处理 受检者得准备 检查对象生活饮食处于日常状态、 采集部位 静脉采血 抗凝剂 EDTＡ或肝素抗凝血 要求 1、样本量1ml。 2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻或溶血得标本不能用。 3、样本白细胞计数应在４、0-1０、０×109/L之间。若>10。0×109/L, 样本需要稀释,用PＢS稀释;若〈4.０×1０9／L,应分离单个核细胞。
试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特 成分 1:单克隆抗体 液体 ２—8℃ (CD4５／4/８/３ Nｏ、6607013 CＤ45/56/１9/３ No.66070７3 CD4/8/3 Nｏ.IＭ1650 同型对照IgG1／IｇＧ1/ＩｇG１ Nｏ。IM1６72 CＤ3／1９ Ｎo、ＩM1２9３ CＤ３/16+5６ Nｏ、IM2076 CD１9—PC5 No.IM264３ Ｆｌow－Coｕnt荧光微球 Ｎo。) 2:全血溶血试剂(Q-Pｒeｐ) 液体(Ｎo。7546946) A:甲酸 液体 70MＬ 室温 B:碳酸钠等 液体 32MＬ 室温 C:多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilysｅ C Ｎo、IM1４01) 液体 室温 ３:鞘液(No。854６85９) 液体 ２0L 室温 4:清洗液(No。85469３0) 液体 5L 室温 5:荧光微球(No、66053５9) 液体 10ML ２-8℃(Flow-Ｃheck) 仪器 BeｃkmanCouｌter ＥＰICS ＸL／ＦC５00／Aｌtra 样本制备: 1)按照要求,分别向已编好号得试管中加入10/20 ul单克隆抗体与同型对照 ２)分别向试管中加入混匀得10０ｕ1抗凝血、 ３)混匀,避光,室温孵育20-３0分钟 4)溶血:a。 OpｔiＬysｅ C(按说明书步骤溶血) b、 使用COULTER Ｑ—PREP制备系统 开机－－-显示ＲＥＡＤY灯亮—-－选择３5SEＣ灯亮———开门—－-放入试管关门－——自动进行溶血－—－显示READY灯亮-——开门-—-取出试管－--再进行下一个样品测定、 (*溶血前确认A／Ｂ/C管路充满并能打出液体) 5)上机测样(可根据样本情况选择洗或不洗上样) 6)需要做绝对计数得指标,在相应管中加入与血样等量得Ｆｌoｗ-Count(务必做到三同:同枪,同人,同种方法加Floｗ-Cｏｕnt,而且加完即上机) 报告结果 报告百分数(与绝对值)
操作性能 精密度 批内五次重复CV＜2％ 参考值(百分数(绝对值)) CD3+ 60、8—75.４％(1141—1880) CD４+ 29。4－45、8%(4７8—10７2) CＤ8＋ 1８。２—3２.8％(393-74２) NK 9.5—2３。5% (175－56７) Ｔh/Ｔs 1。05—2。0３ 临床意义 1、Ｔ、B淋巴细胞亚群就是重要得免疫状态检测指标,在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染,自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。 临床常用Th/Tｓ比值来判断病人得免疫状况。 Th/Ts比值升高:表示免疫功能亢进:见于自身免疫性疾病,如SＬE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg＋乙肝等。 Th／Ts比值减低:表示免疫功能下降:艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝与活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。 2:NＫ细胞主要破坏各种肿瘤细胞与感染某些病毒、细菌得细胞,所以在抗肿瘤与防御疾病中起主要作用。ＮK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂,疲劳综合征病人等,ＮK活性随年龄增长而减退。ＮＫ细胞也参与第二型超敏反应与移植物抗宿反应,白介素—2治疗后;外周血NK细胞增加、
方案(Protocｏl) １.选参数 点击 点击 4色
流式细胞仪操作规程SOP
