___________稻鸭共育模式下水稻根际土壤真菌和细菌种群多样性分析

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2019，50（1）：59-671期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·59·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.01.09稻鸭共育模式下水稻根际土壤真菌和

细菌种群多样性分析

廖咏梅1，黄元腾吉1，韩宁宁1，凌

展2，邹承武1，史鼎鼎1，蒋代华1

530421）

（1广西大学农学院，南宁530004；2南宁市宾阳县中华镇人民政府，南宁

摘要：【目的】比较稻鸭共育模式与常规管理模式种植水稻的根际土壤微生物种群多样性，为利用土壤微生物多样性开展水稻生态栽培提供科学依据。【方法】采集常规管理模式水稻根际土壤样品（记为S2）和稻鸭共育模式水稻根际土壤样品（记为S3），采用电位法测定土壤pH、重铬酸钾—外加热法测定土壤有机质含量；针对土壤样品真菌ITS1~ITS2区域和细菌16SrDNA扩增子V3~V4区域进行IlluminaMiSeq2×300bp双末端测序，分析两种模式土壤真菌和细菌的种类及丰度差异。【结果】S3的pH为5.10，有机质含量为23.91g/kg；S2的pH为5.34，有机质含量为19.84g/kg。在真菌门水平上，两种管理模式的根际土壤优势门均为子囊菌门（Ascomycota），S3中子囊菌门的相对丰度为42.36%，S2为93.67%，两者相差2.21倍；在真菌属的水平上，S3的优势属为毛壳菌属（Chaetomium），相对丰度为2.63%，而S2的毛壳菌属相对丰度仅为0.26%，两者相差10.12倍；S3中居第2位的属是嗜热真菌属（Mycothermus），相对丰度为2.21%，而S2的嗜热真菌属相对丰度为0.05%，两者相差44.20倍；S2的优势属是黑盘孢属（Melanconiella），相对丰度为6.66%，而S3的黑盘孢属相对丰度为0.26%，两者相差25.62倍。两种管理模式下相对丰度居前2位的细菌门均为变形菌门（Proteobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria），S3中变形菌门的相对丰度为40.90%，S2为29.45%，两者相差1.38倍；S3中酸杆菌门的相对丰度为18.90%，S2为27.84%，两者相差1.47倍；两种管理模式下相对丰度居前10的细菌属相同，其中7个属隶属变形菌门［其中3个属隶属于根瘤菌目（Rhizobiales）、3个属于隶属粘细菌目（Myxococ-cales）、1个属隶属于δ-变形菌纲未分目（unidentifiedDeltaproteobacteria）］、3个属隶属于酸杆菌门，10个属中仅有红微菌属（Rhodomicrobium）在两种管理模式土壤中相对丰度相差2.23倍（S3为1.18%，S2为0.53%），其他9个属相差均在1.00倍左右。【结论】与常规管理模式比较，稻鸭共育模式的水稻根际土壤pH略低，有机质稍高，真菌的种群结构丰富，而细菌的优势门和优势属无明显差异。

关键词：稻鸭共育模式；水稻；根际土壤；真菌；细菌；种群多样性中图分类号：S344

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2019）01-0059-09

Analysisofpopulationdiversityoffungiandbacteriainrice

rhizospheresoilunderrice-duckfarmingmodel

LIAOYong-mei1，HUANGYuan-teng-ji1，HANNing-ning1，LINGZhan2，

ZOUCheng-wu1，SHIDing-ding1，JIANGDai-hua1

2

（1CollegeofAgriculture，GuangxiUniversity，Nanning530004，China；ThePeople’sGovernment

ofZhonghuaTown，BinyangCounty，Nanning530421，China）

Abstract：【Objective】Themicrobialpopulationdiversityinrhizospheresoilbetweenrice-duckfarmingmodeland

conventionalmanagementmodelinriceplantingwascomparedinordertoprovidescientificbasisontheutilizationofsoilmicrobialdiversitytodevelopriceecologicalcultivation.【Method】Rhizospheresoilsamplesfromconventionalmanage-mentmodel（markedasS2）andfromrice-duckfarmingmodel（markedasS3）werecollectedinthefield，pHvalueofsoilsamplesweretestedbypotentialmethod，soilorganicmattercontentwasdeterminedbypotassiumdichromateandex-ternalheatingmethod.ITS1-ITS2regionofsoilfungiandV3-V4regionof16SrDNAampliconofbacteriainthesoilsamplesweresequencedbyIlluminaMiSeq2×300bpdoubleterminalsequencingmethod.Thenfungiandbacteriaspe-ciesandabundancedifferencesofsoilsamplesintwocultivationmodelswereanalyzed.【Result】ThepHvalueofS3sam-plewas5.10，organicmattercontentwas23.91g/kg；thepHvalueofS2was5.34，organicmattercontentwas19.84g/kg.Infungiphylalevel，Ascomycotawasthedominantphyluminricerhizospheresoiloftwocultivationmodels，inwhichtherelativeabundancewas42.36%inS3sample，but93.67%inS2sample，2.21timesindifference.Infungigeneralevel，收稿日期：2018-07-18基金项目：国家自然科学基金项目（31160364）作者简介：廖咏梅（1963-），博士，教授，主要从事植物病理学及农作物生态种植研究工作，E-mail：liaoym@gxu.edu.cn

·60·南方农业学报50卷ChaetomiumwasthedominantgenusinS3sample，therelativeabundancewas2.63%.ButinS2sample，therelative

abundanceofChaetomiumwas0.26%only，10.12timesindifference.TheseconddominantgenusinS3samplewasMy-cothermuswhoserelativeabundancewas2.21%，butinS2sample，itsrelativeabundancewas0.05%，44.20timesindif-ference.MelanconiellawasthedominantgenusinS2samplewhoserelativeabundancewas6.66%，butinS3sampletherelativeabundanceofMelanconiellawas0.26%，25.62timesindifference.Intwomanagementmodels，toptwobacteriaphylawereProteobacteriaandAcidobacteria，inwhichtherelativeabundanceofProteobacteriawas40.90%inS3sam-ple，29.45%inS2sample，1.38timesindifference；therelativeabundanceofAcidobacteriais18.90%inS3sample，27.84%inS2sample，1.47timesindifference.Intwomanagementmodels，thetoptenbacteriagenerawerethesame，inwhichsevengenerabelongedtoProteobacteria（amongthesevengenera，threegenerabelongedtoRhizobiales，threegenerabelongedtoMyxococcales，onegenusbelongedtounidentifiedDeltaproteobacteria），andthreegenerabelongedtoAcido-bacteria.Amongtengenera，therelativeabundancedifferencewasabout1.00time，onlyRhodomicrobiumwas2.23timesdifferencebetweentwomanagementmodels（therelativeabundancewas1.18%inS3，0.53%inS2）.【Conclusion】Comparedwiththeconventionalricemanagementmodel，thepHvalueisslightlylower，theorganicmatterisslightlyhigherinrice-duckfarmingmodel.Amongsoilsamplesfromtwomanagementmodels，thepopulationstructureoffungiisabundant，andthereisnogreatdifferenceindominantphylaandgeneraforbacteria.

Keywords：rice-duckfarming；rice；rhizospheresoil；fungi；bacteria；populationdiversity

0引言

【研究意义】微生物是土壤有机物的分解者（王芳和图力古尔，2014），同时是土壤有机质和养分转化与循环的动力，是土壤中植物有效养分的储备库（徐一兰等，2016），土壤微生物群落变化在一定程度上可反映土壤质量的变化趋势（张薇等，2005）。稻鸭共育模式种植水稻是指通过鸭子除草除虫及排便肥田，免施化肥与化学农药（含除草剂）的水稻种植方式；而常规种植模式需通过施用化肥、化学农药及除草剂进行管理。化肥和化学农药的过量施用会导致土壤酸化，土壤微生物种群结构也相应发生变化。因此，探讨该两种栽培模式下水稻根际土壤酸度、有机质含量及微生物的种群多样性，对发展有机水稻产业具有重要意义。【前人研究进展】随着分子生物学和高通量测序技术的发展，近几年有关土壤微生物多样性的研究报道较多。王轶等（2014）以有20年历史的长期定位试验田为研究对象，利用末端限制性片段长度多态性分析技术研究土壤真菌群落的多样性，结果发现长期施用有机肥与施用化肥相比可提高土壤真菌多样性，改变其群落结构；陆晓菊等（2015）采用人工分离和PCR研究三七连作6年的健康植株与根腐病植株根际土壤细菌种群结构，结果发现三七连作土传病害的发生与土壤细菌的种群结构及其优势细菌的种群比例具有密切的关联性；杜思瑶等（2017）采用Illumina平台Hiseq2500高通量测序技术，研究有机和常规设施种植模式及轮作对土壤细菌多样性和群落结构的影响，结果表明有机设施种植的土壤细菌多样性高于常规设施种植，有机设施种植下轮作与连作土壤的细菌群落结构表现出明显差异，而常规设施种植下轮作与连作土壤的细菌群落结构无明显差异；韦俊等（2017）采用16S

rRNA测序技术分析不同套作模式下烤烟根际土壤

细菌群落结构及多样性差异，发现套种模式比单作烤烟根际土壤细菌多样性明显提高，且不同程度地降低土壤中潜在的致病菌丰度。可见，土壤微生物种群结构多样性与植物的健康生长密切相关。【本研究切入点】前人主要针对旱地中的土壤细菌或真菌种群多样性进行研究，而针对稻鸭共育模式和常规管理模式下稻田土壤微生物种群多样性的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】基于IlluminaMiSeq测序平台，利用双末端（Paired-End）测序方法，构建真菌ITS1~ITS2区域和细菌16SrDNA扩增子V3~V4区域的小片段文库，进行双末端测序，分析稻鸭共育模式与常规管理模式稻田土壤真菌和细菌的种类及丰度差异，揭示化肥和农药对土壤微生物种群结构的潜在影响，为利用土壤微生物多样性开展水稻生态栽培提供科学依据。

1材料与方法

1.1

土壤样品采集于水稻蜡熟期（2017年7月18日）从广西宾阳县思陇镇采集水稻根际土壤，采样时水稻即将收获，田水已排干，土壤已基本硬化。采自水稻常规管理模式水稻田的土壤样品标记为S2，该田块采用化肥、化学农药和除草剂进行常规管理；采自稻鸭共育模式水稻田的土壤样品标记为S3，该田块位于常规管理模式田块的隔壁。用五点取样法，每点连根带泥拔2株水稻植株，共10株，收集根际土壤混匀后带回实验室。每处理土壤样品分成2份，1份用于pH和有机质含量检测，1份用于DNA提取和测序。1.2土壤样品pH和有机质含量检测

采用电位法（S220型梅特勒—托利多酸度计）测定土壤pH，水∶土＝2.5∶1.0。用重铬酸钾—外加

1期廖咏梅等：稻鸭共育模式下水稻根际土壤真菌和细菌种群多样性分析

·61·热法测定土壤有机质含量（鲍士旦，2000）。

1.3土壤样品真菌ITS1~ITS2区域和细菌16SrDNA扩增子V3~V4区域测序及多样性分析

提取土壤的总DNA，针对真菌的核糖体内转录间隔区（Internaltranscribedspacer，ITS）的ITS1~ITS2区域，及细菌16SrDNA扩增子序列（16SrDNAam-pliconsequencing）V3~V4区域，基于IlluminaMiSeq测序平台，利用双末端测序方法构建小片段文库进行双末端测序（2×300bp）。通过对Reads拼接过滤、操作分类单元（Operationaltaxonomicunits，OTUs）聚类、物种注释及丰度分析，根据物种注释结果，选取每个样品在不同分类水平上最大丰度排名前10的物种及其相对丰度绘制柱形累加图，以便直观查看各样品在不同分类水平上相对丰度较高的物种及其比例；再对OTUs进行Alpha多样性指数等分析，对不同样品在97%一致性阈值水平下的Alpha多样性指数进行统计，比较样品间的差异。样品测序与分析委托广西普斐生物信息科技有限公司完成。

2结果与分析

2.1

土壤样品pH和有机质含量测定结果

两种水稻栽培管理模式土壤样品的测定结果显示，S2的pH为5.34，有机质含量为19.84g/kg；S3的pH为5.10，有机质含量为23.91g/kg。可见，两种模式的土壤样品均呈酸性，与常规管理模式比较，稻鸭共育模式的土壤有机质含量增加，但土壤pH略低。2.2土壤样品真菌种群多样性分析结果

2.2.1测序数据的获得从S2的总DNA中测得原始序列36073条，平均每条长度为280nt，对原始数据进行拼接、过滤，得到有效序列35425条，有效率98.20%；从S3的总DNA中获得原始序列38843条，平均每条长度283nt，有效序列38438条，有效率98.96%。从OTUs丰度稀释曲线（图1）可看出，随着测序数据量的增大，稀释曲线斜率逐渐下降，趋向平坦，说明测序数据量足够反映出样品中的物种组成特征。从样品分类等级稀释曲线（图2）可看出，S3中的物种丰富度和均匀度均高于S2。

2.2.2OTU分析结果使用UPARSE对样品的有效序列进行聚类，相似性≥97%的tag聚为同一OTU，共获得436个OTUs，使用代表性序列与每个样品进行比较，发现S2包含260个OTUs，而S3包含373个OTUs。将所有样品进行均一化处理后绘制韦恩图，分析不同样品间共有和特有的OTUs，结果如图3所示。S2和S3有197个共有OTUs，S2特有的OTUs63个，S3特有的OTUs176个，即S3的真菌种类多于S2。

U）S2

TS3

S3

（O300

rebmunU200

S2

TO数（个）100

UTO0

0

100002000030000序列数Sequencenumber

图1土壤样品真菌OTUs丰度稀释曲线

Fig.1DilutioncurveoffungiOTUsabundanceinsoilsample

e100.00cnS2adS3

nub10.00aevita1.00le）R0.10

度（%S3

丰对0.01

相S2

0

100

200

300

400

物种等级Speciesrank

图2土壤样品真菌分类等级稀释曲线

Fig.2Dilutioncurveoffungusrankinsoilsample

S2和S3的Chao1指数分别为362.14和381.78，Shan-non指数分别为2.20和5.45。可见，与S2比较，S3的真菌种群更丰富。

S3

S2

图3土壤样品真菌OTUs韦恩图

Fig.3VenngraphoffungiOTUsfromsoilsamples

2.2.3真菌门水平的注释及相对丰度使用UNITEITS数据库对OTUs的代表序列进行物种注释。在真菌门的水平上共注释出5个门，包括子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）、担子菌门Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和囊球菌门（Glomeromycota）。S2和S3的最优势门均是子囊菌门；S2中，子囊菌门的相对丰度为93.67%、接合

（