纤维素酶产生菌的筛选及酶学性质研究
孙玉宇
【摘 要】摘 要:从城市生活垃圾中分离到一株分解纤维素能力最强,并产生胞外酶的菌株,初步确定为芽孢杆菌,并对该菌所产的纤维素酶的酶学性质进行了初步研究.该纤维素酶反应最佳温度为 50℃;最适 pH7.0;酶在 40～50℃热稳定性较好;CMCase活力在 pH 6.0～7.0处可保持70%以上,FPA酶活在pH 6.0～7.0处可保持79%以上;Ca2+和Mg2+对酶反应表现为明显的促进作用,而Fe3+和Mn2+对酶反应有抑制作用,Na+、Zn2+和K+对酶的影响很小. 【期刊名称】湖南理工学院学报（自然科学版） 【年(卷),期】2014(000)002 【总页数】4
【关键词】关键词:纤维素酶产生菌;筛选;稳定性;抑制剂
引言
纤维素酶是能水解纤维素 β-1,4-葡萄糖苷键,使纤维素转变为纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称[1],其应用前景十分广阔.目前,纤维素酶应用的范围已经扩展到发酵、日用化工、饲料生产、纺织行业、废水处理及石油开采等各个领域[2]. 我国城市生活垃圾量大且组成复杂,垃圾中纤维素占主要成分,而纤维素又属于难降解部分.如何有效开发和利用纤维素资源以及处理纤维素已成为目前研究的热门问题.纤维素的降解主要依靠纤维素降解菌产生的纤维素酶,目前人类掌握的微生物对纤维素的降解能力都有限,还不能满足人类发展的需要.因此,筛选出一种高效的纤维素降解微生物就成为一项紧迫的战略任务.
本项目研究的目的在于筛选出一株能高效降解纤维素的细菌,并研究其纤维素酶
的酶学性质,旨在为该菌的应用研究提供参考,对解决环境污染等问题将具有深远影响.
1 材料和方法
1.1 材料
样品:来源于洛阳市瀍河区盘龙冢垃圾填埋场的土壤样品.
培养基:富集培养基(酵母粉1g、蛋白胨5g、碳酸钙5g、氯化钠5g、新华滤纸20g、蒸馏水1000mL、pH8.0、37℃封口静置培养);纤维素刚果红筛选培养基(MgSO4 0.5g、(NH4)2SO4 2g、K2HPO41g、NaCl 0.5g、羧甲基纤维素钠 CMC-Na 2g、刚果红0.4g、琼脂22g、蒸馏水1000mL,pH7.0);液体发酵培养基(CMC-Na 10 g,KH2PO41 g,MgSO4 0.2 g,NaCl 10g,MgSO40.2g,蛋白胨10g,蒸馏水1000 ml,pH7.0).
酶活测定用溶液:葡萄糖标准溶液(1 mg/mL)、CMC-Na缓冲液(0.5 %)、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH4.8)、DNS试剂、新华滤纸1#. 1.2 仪器设备
VS-840-2型单人垂直双面净化工作台、721型可见分光光度计、101型电热鼓风干燥箱、QYC全自动控温摇床、H-205R型台式高速控温离心机、电热恒温培养箱(HH.BII.600型)、PHS－3C 型精密 pH 计、全自动立式压力蒸汽灭菌器、JA2002电子天平、HH-4型电热恒温水浴锅、XSP-6C电子显微镜等. 1.3 方法
1.3.1 纤维素酶产生菌的筛选
取10mL样品悬液接种于富集培养基中,置于37℃、120 r/min恒温箱中培养48h后进行梯度稀释,涂布于纤维素刚果红筛选培养基上,37℃培养48h,挑选出
透明圈直径与菌落直径比值较大、较快生长的单菌落作为初筛菌株,将其接种于液体发酵培养基中,37℃培养48 h后,4℃离心15min,取上清液测定羧甲基纤维素酶(CMCase)活性和滤纸酶(FPA)活性,同时,将发酵液超声波(200 W,破碎5s,间隔5s,10次)破壁后离心,取上清测定酶活性以筛选产胞外酶菌种. 1.3.2 酶活性测定
采用3,5-二硝基水杨酸显色法(DNS法)[3]测定羧甲基纤维素酶(CMCase)活性和滤纸酶(FPA)活性.酶活性单位(kat)定义,40℃条件下,每秒钟转化底物产生1mol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为1 kat. 1.3.3 菌种的初步鉴定
通过对菌落的形态观察、菌株革兰氏染色、芽孢染色以及生理生化试验进行初步鉴定.
1.3.4 酶学性质的研究 (1)酶反应的最适温度
将提取的酶液在pH7.0的环境下,分别置于40℃,45℃,50℃,55℃,60℃不同温度条件下与底物反应后测其酶活(CMCase和FPA),以确定最适的温度. (2)酶反应的最适pH值
在上述测得的最适温度下,将酶的提取液分别置于pH为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0的条件下与底物反应后测其酶活(CMCase和FPA),确定最适pH值. (3)温度对酶稳定性的影响
将提取的酶液分别置于40℃,45℃,50℃,55℃,60℃不同温度下保温30min,按常规方法在上面得到的最适温度和pH条件下,测定剩余酶的活力(CMCase和FPA).
纤维素酶产生菌的筛选及酶学性质研究
