RTPCR检测穹窿海马伞切割后大鼠海马内Lhx8mRNA的表达变化

RT-PCR检测穹窿海马伞切割后大鼠海马内

Lhx8 mRNA的表达变化

作者：秦建兵，金国华，蒋媛媛，王 磊，朱蕙霞，田美玲，张新化

【摘要】 目的：探讨切割穹隆海马伞大鼠海马与正常海马内Lhx8 mRNA表达的差异。方法：36只SD大鼠随机分成6组，每组6只。1组为正常对照组，其余5组分别为切割穹窿海马伞后3、7、14、21和28 d组。取各组大鼠的海马组织，提取总RNA，采用半定量RT-PCR法分析穹隆海马伞切割后海马内Lhx8 mRNA的表达变化。结果：海马内Lhx8 mRNA的表达量在切割后第3 d开始升高，7 d时达到最高水平，以后逐渐下降，于28 d时恢复至正常水平。结论：切割穹窿海马伞后海马中Lhx8 mRNA表达的增高可能与神经干细胞向胆碱能神经元分化的再生机制有关。

【关键词】 穹窿海马伞切割 海马 Lhx8 逆转录－聚合酶链反应 大鼠

[Abstract] Objective: To observe the difference of Lhx8 mRNA expression in hippocampi between the fimbria fornix transected rats and normal ones. Methods: 36 SD rats were randomly divided into 6 groups, 6 rats in each group. Group one

was the control group, and the others were 3rd, 7th, 14th, 21st and 28th day group after fimbria fornix transected. Then hippocampi were isolated and total RNA was extracted. Semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis was used to detect the expressions of Lhx8 mRNA in hippocampi. Results: The expression level of Lhx8 mRNA started to increase from the 3rd day after fimbria fornix transection. The peak appeared on the 7th day, and the expression decreased slowly to pre-transection level on the 28th day. Conclusion: The increase of Lhx8 mRNA expression after fimbria fornix transected might be related to the regeneration mechanism of differentiation of neural stem cells into cholinergic neurons in hippocampus.

[Key words] Fimbria fornix transection; Hippocampus; Lhx8; Reverse transcription-polymerase chain reaction; Rat

移植于切割穹窿海马伞齿状回中的神经干细胞较正常侧海马齿状回中植入的神经干细胞更易于存活、迁移和向神经元分化[1,2]。体外实验也证实切割穹窿海马伞的海马提取液能明显促进神经干细胞向神经元和胆碱能分化[3]。这些结果提示切割穹窿海马伞后海马中某些能诱导神经干细胞存活、迁移和向神经元分化的信号物质表达增高。Lhx8是LIM同源盒基因家族中的一员，它主要选择性的表达在MGE(medial ganglionic eminence, MGE)区，对于胆碱能神经元的分化有至关重要的作用[4]。但迄今为止Lhx8基因在病理模型中的表达研究仍是空白。本研究旨在观察切割穹窿海马伞后大鼠海马内Lhx8 mRNA表达是否增高，以推测Lhx8与切割穹窿海马伞海马促进移植入其中的神经干细胞向神经元或胆碱能神经元分化关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SD大鼠36只（南通大学实验动物中心提供），雌雄不拘，体重220～250 g，随机分成6组，其中1组为正常对照组，其余5组分别为手术后3、7、14、21和28 d组，每组6只。

1.2 切割大鼠穹窿海马伞 上述各手术组SD大鼠，经腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent（0.2 ml/100 g）麻醉后，固定于立体定位仪，暴露前囟，确定前囟坐标A(矢状轴)、L(冠状轴)、V(垂直轴)，根据Paxinos图谱确定左右两侧穹隆海马伞的切割范围。先在颅骨上确定右侧两点即：（1）A1=A－1.4、L1＝L－4和；（2）A2＝A－1.4、L2＝L－4；左侧两点即；（3）A3=A－1.4、L3＝L＋1和（4）A4＝A－1.4、L4＝L＋4，每点各钻一小孔，用刀片将右侧（1）和（2）、左侧（3）和（4）点间颅骨划开一条骨缝，将针刀插入脑内至切割深度即V1－4＝V+5.4，来回切割3次，退出针刀，待无颅内出血后用骨蜡封闭骨缝，缝合皮肤，肌注青霉素，动物按性别分笼饲养。

1.3 RNA的提取和保存 正常组及手术后各组大鼠经上述方法麻醉后，断颈处死，无菌条件下剥去颅骨和硬脑膜，再去除大脑皮质和胼胝体，证实两侧穹窿海马伞被切断后，取出两侧海马组织，用Trizol法提取RNA，沉淀用50 μl DEPC-H2O溶解。取少量样品进行紫外定量，用甲醛变性电泳鉴定RNA质量，其余样品保存于－70 ℃冰箱中备用。

1.4 半定量RT-PCR 选用磷酸甘油醛脱氢酶 (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参照。反应中所用GAPDH上游引物为：5'-ACCACAGTCCATGCCATCA C-3'，下游引物为：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，扩增产物为452 bp；Lhx8上游引物为：5'-ATGTATTGGAAGAGCGATCAG-3'，下游引物为：5'-TCATTGGATGGGG TAACAAGGGC-3'，扩增产物为1102 bp。GAPDH和Lhx8的cDNA序列查自GenBank，引物由上海英骏公司合成。PCR反应：将目的基因与内参基因的引物置同一管内行PCR扩增，反应体系按试剂DNA聚合酶(MBI公司)说明书操作。预变性94 ℃、3 min，然后94 ℃、45 s，60 ℃、30 s，72 ℃、65 s，30个循环；最后72 ℃、10 min。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，捷达图像分析系统对凝胶各泳道中的GAPDH和Lhx8条带进行光密度扫描。