API 20E 肠杆菌和其它革兰氏阴性杆菌鉴定系统

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API 20E 肠杆菌和其它革兰氏阴性杆菌鉴定系统

文章出处：长源科技 发布时间：2005-08-10

API 20

E是肠杆菌科和其它G-杆菌的标准鉴定系统，包括23个标准化微型生化测试和鉴定资料库。可鉴定菌谱名录，请参考鉴定表。

原理

API 20

E试验条是由20个含干燥底物的小管所组成。这些测定管用细菌悬浮液接种。培养一定时间後，通过代谢作用产生颜色的变化，或是加入试剂後变色而观察其结果。

根据说明表判读反应，参照分析图索引和APILAB Plus软件得到鉴定结果。 试剂

一个ref. 20100（25测试）试剂盒包括： －25条API 20 E试验条； －25个培养盒； －25张报告单 －1个封口夹

－1份API 20E操作说明书

一个ref. 20160（100测试）试剂盒包括: －100条API 20 E试验条 －100个培养盒 －100张报告单 －1个封口来

－1份API 20 E说明书

附加试剂（不包括在试剂盒内）

－NaCl 0.85% 悬浮液， 5 ml (Ref. 20230)或Suspension Medium县浮液，5 ml (Ref. 20150) －API 20 E试剂盒 (Ref. 20120)

(TDA,IND,VP 1,VP 2,NIT 1,NIT 2和OX)或单一附加试剂: TDA (Ref. 70400)

JAMES(Ref. 70540) VP 1(Ref. 70420) VP 2 (Ref. 70430) NIT 1 (Ref. 70440) NIT 2 (Ref. 70450) OX (Ref. 70460) －Zn试剂 (Ref. 70380) －石腊油 (Ref. 70100)

－API专用一次性加样管 (Ref. 70250) －API LAB PLUS鉴定结果分析软件 －附加试剂安瓿架 (Ref. 70200)

必要时，需要以下附加试剂

API OF Medium (Ref. 50110)

－测定其发酵型或氧化型代谢作用； API M Medium (Ref. 51020)

－测定兼性厌氧细菌的运动性。

所需一般实验室设备

－培养箱(35~37℃) －冰箱

－本生煤气喷灯或酒精灯 －记号笔

培养基和试剂成份

NaCl 0.85% 培养基5ml

or悬浮基物5ml NaCl 无离子水 1000ml

8.5g 无离子水

TDA试剂 5ml Fecl3 3.4g H2O 加至 100ml

JAMES试剂 5ml J 2183化合物 (保密) 0.5g HCl 1N 加至100ml S24/25:

避免接触皮肤和眼.如与眼接触，必须立即用水冲洗至少10分钟。如与皮肤接触，用肥皂洗和用水冲洗。

IND试剂 5ml 对二苯氨基苯甲醛 5g HCL 9.25g H2O 15.75ml 异戊醇 75ml 危害 R10: 可燃 R20: 吸入伤害

S24/25:避免皮肤和眼接触

VP 1试剂 5ml KOH H2O 100ml 有毒性 R35: 引起严重伤害. S2:避免儿童接触.

S26:如接触眼睛，立即冲洗，做医疗处置. S27:.立即拿走沾染的衣物 S37/39: 戴手套，保护眼/脸

VP 2试剂 5ml a-奈酚 乙醇 100ml 高度易燃 S7: 严密容器存放

S16: 远离火源，不能吸烟.

NIT 1试剂 5ml 对氨基苯磺酸 乙酸 30g H2O 70ml 具腐蚀性 R34:引起灼伤 S2:避免儿童接触 S23:避免吸入蒸气

S26:若与眼接触，即用水冲洗，并治疗处置.

NIT 2试剂 5ml N, N-二甲基- 奈酶胺 乙酸 30g H2O 70ml

40g 6g 0.4g 0.6g 具腐蚀性 R34:引起灼伤 S2:避免儿童接触 S23:不能吸入蒸气

S26:若与眼接触，即用水冲，并治疗处理.

OX试剂 5ml 四甲基-对-苯撑二胺 1g 异戊醇 100ml 危害 R10:易燃. R20:吸入伤害.

S24/25: 避免接触皮肤和眼 Zn试剂 10g 锌粉 易燃

R15: 若接触水可产生依然气体 R17: 在空气中可自燃

S7/8: 保存干燥密封的容器

S43: 若引起火, 使用粉末灭火器'不得使用水.

试验条的储存

试验条采用铝袋包装并附有干燥剂。在开启铝袋後，请使用封口夹(试剂盒已含有)封口，以保证试条的干燥。开启铝袋後，在2-8℃环境下，试验条可享有10个月的有效期(或包装盒上的有效期，以较短时间为准)。

附加试剂的储存

附加试剂应储於黑暗2-8℃环境下（除TDA, VP 1 及NIT 1可储於2-30℃及Zn可储於8-30℃）直至有效期。 当安瓿瓶打开後，所有试剂只有一个月有效期（或包装盒上的有效期，以较短时间为准）。 请小心记录开启安瓿的时间。

OX和JAMES试剂对光非常敏感：请用箔纸包裹里，只在使用时才从冰箱中取出，同时应避免长时间放至放室温中

。

附加试剂的使用

在使用前，所有附加试剂需达到室温（20-30℃）

1. API 20 E试剂盒：

－压下安瓿瓶盖直至和安瓿瓶尖接触。

－垂直握住安瓿，用大拇指施加压力於瓶盖斜面以推断安瓿尖。 －将安瓿瓶倒置，并保持垂直。 －小心拧松瓶盖以滴出试剂。

2. TDA, VP 1, VP 2, NIT 1, NIT 2和OX附加试剂(附有滴头的安瓿) －根据"警告及留意"一栏所列方法打开一安瓿试剂。 －滴出一滴试剂後小心盖上安瓿。

－根据"试剂的储藏"一栏，储存试剂。 3. JAMES附加试剂（不附有滴头的安瓿）

－根据"警告及留意"一栏所列方法打开一安瓿JAMES附加试剂溶液。 －使用干燥加样枪将全部溶瓶加入含有冻干成份的滴瓶中。 －将滴头插入滴瓶。 －小心关紧瓶盖。 －摇动滴瓶。

－等待5-10分钟直至所有有效成份溶解。

－使用试剂後，拧紧瓶盖，根据"试剂的储藏"一栏，储存试剂。 4. Zn附加试剂 －打开小瓶

－取大约2-3mg Zn粉未,使用小刮铲将粉未加入反应小管.

－使用试剂後，拧紧瓶盖，根据"试剂的储藏"一栏，储存试剂。

警告及留意事项

只供体外诊断用。

合格检验科工作人员应采用无菌操作方法并防范带传染性物质。 不应用口吸取标本或试剂。 不应使用过期试剂。

由冰箱取出後，所有试剂需达室温(20-30°C)方能使用。 小心开启安瓿瓶：

－用手垂直握住安瓿瓶(白色瓶盖向上) －尽量将瓶盖压下

－用大拇指顶住瓶盖上斜面部份 －向外施加压力直至瓶盖内瓶尖断裂 *无滴头安瓿：小心移开瓶盖

*附滴头安瓿：垂直倒置安瓿瓶，挤压瓶盖将所有试剂加入滴瓶

所有加样後产品应视之带有污染性，需小心处理。

所有病人标本和细菌培养均可能带有污染性，应跟据国际标准处理(NCCLS M29-72: CDC

Manual

Biosafety in Microbiological & Biomedical Laboraties, 1993)

在完成检测、判读後，所有标本，污染物及试条必须高温高压消毒，烧成灰或在丢弃前浸於消毒水内杀菌。

最後鉴定的结果需由合格微生物学家肯定，同时需考虑病史、标本来源、菌落及显微镜下生长形态、其他测试结果，例如药敏结果。

使用说明

所有细菌培养及标本需视为带有传染性，只有合格检验师方能操作无菌技术及遵守有关细菌操作注意事项(NCCLS

M29-72, Protection of Laboratory Worers from Infections Diseases, Tranmitted by Blood, Body flumids, & Tissue - 2nd Edition; Tentative Guidelines及Biosefety in Microbiological & Biomedical Laboratories.HHS

Publication No. CCDC) 93-8395, 3rd Edition (May 1993). 或本地规定。) 试验条的准备

准备一个培养盒（盘和盖子），倒入约5ml水於盘的蜂窝小凹中，造成一个湿室。 记菌株资料於盘的边沿部分。 从包装中取出试验条放到盘中。 进行Oxidase氧化酶检测:

-在玻片上放上张滤纸片。 -在滤纸上滴一滴水。 -取一个菌落涂在滤纸上。 -加一滴OX试剂

-如於1至2分钟内呈现深紫色，则为阳性反应。 反应结果应记录於结果报告单上成为第21个测试。

注意：API 20 E鉴定菌谱不包括苛养菌，需采用特别步骤排除需特别营养/培养步骤的菌株。

接种物的制备

－根据"警告及留意"一栏所列方法打开一安瓿NaCl 0.85% (5ml)或Suspension

Medium (5ml)或使用无杂质无菌5ml盐水/蒸馏水。

－以接种针从分离物的平板上挑取已分纯单个菌落至悬浮基物中。 －仔细研匀以达到均一的细菌悬液

注意：大多数弧菌均嗜盐，如怀疑菌株为弧菌，请使用NaCl 0.85%(5ml) medium 悬浮液。

试验条的接种

用吸管将细菌悬液充满檬酸CIT、VP各GEL管； 其它管仅充满管部(不是杯部)；

ADH、LDC、URE、ODC和H2S，则用矿物油覆盖； 盖上盖子，孵育於35~37℃ 18~24小时。 於周未孵育：API 20

E的生化反应需於孵育18-24小时後判读，如无法进行试条需於温箱取出并置於2-8℃直至可以进行判读。

判读试条

在35~37℃培养18~24小时後，参考说明表判读其结果； 记录由自发代谢作用而产生的结果於报告单上；

如果葡萄糖是阳性并且/或3个或3个以上测定是阳性的话：加试剂观察结果；

-VP测定：各加1滴VP1和VP2试剂，至少等待10分钟，浅粉或红色表明阳性结果，记录於报告单。如浅粉红色在10至 12分钟内出现，判断结果为阴性。 -TDA测定：加一滴TDA试剂，深褐色为阳性反应，记录於报告单上。 -IDN测定：加一滴James试剂。反应立即发生：粉红色出现在整个反应应管者为阳性，记录於报告单上。或加一滴吲哚 试剂，等2分钟，出现红色环表明为阳性反应。

-NO2测定：各加一滴Nit 1 和Nit 2试剂於葡萄糖管内，待2~3分钟後，红色表示阳性，阴性反应（黄色）可能由於还 原至N2（有时还有气泡）：加2-3mg锌粉到葡萄糖管，5分钟後，如果管保持黄色表示N2阳性记录於报告

单。如果测 定变粉红，这明是阴性；硝酸盐仍留管内，被锌粉还原。 此测试能有效帮助对革兰氏阴性，氧化酶阳性杆菌的鉴定。

注意：Nitrate还原及Indole测试需在最後进行，因为以上反应会产生氧体，影响其他反应判读。在加入有关试剂後，请小心勿调换培养盒。

如果萄萄糖是阴性，并且阳性测定的数目少於2个或等於2个，先不加试剂： -接种2个API OF培养基证葡萄糖的代谢类型； -划一个MacConkey平板；

-接种1个API M培养基测定运动性或用显微镜直接观察； -重新培养24小时； -如上述那样加入试剂；

-记录试验条和补充试验的结果於告单，参考说明表。 鉴定

－用分析图形检索或APILAB Plus软件：所得反应的类型必须以数字化形式记录在报告单，每3个测定为一组，每个以1、

2和4标明，在每组中，阳性反应以相应的数字相加，由API

20 E的20个测定可得一个7位数。氧化酶反应构其第21个反应，如阳性则为4。 有时，7位数检索编码还不足以区分菌株，需要进行一些补充试验： -NO3盐还原到亚硝酸盐(NO2)； -亚硝酸盐还原到氮(N2)； -运动性(MOB)；

-在MacConkey(McC)培养基上的生长； -葡萄糖氧化型(OF-O)； -葡萄糖发酵型(OF-F)。

根据相同的原理，将相应的反应编码，则得到一个9个位数的编码。 举例：

5315173-57日勾维肠杆菌

查照分析图形索引和API LAB软件，查照/输入编号後，可得以下信息： -被鉴定出的种名；

-鉴定百分数，T索引是由模式（典型）图形而得；

-如有与鉴定相反的测定结果，一般可看该种的阳性反应%； -鉴定质量的评价；

废物处理

使用後，所有的安瓿，试验条和培养盒在处置之前都必须高压灭菌，烧成灰或浸泡於杀菌剂中。

局限性

－API 20E鉴定系统能准确鉴定在鉴定范围（请查阅鉴定表）内的菌种，但不能用於鉴定/排除鉴定范围外的菌种。

－由於API技术和传统技术的不同，有可能出现不同生化反应结果。 －所有沙门氏菌/沙雷氏菌鉴定需血清鉴定确认。

质量控制

培养基、试验条和试剂在生产的不同阶段都已进行严格的系统性质量控制。对愿意进行自我质量控制者，推荐以标准菌株，所得结果如下：

ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRHASACMELAMYARANO2N2 1+-V-V-----+----------- 2++-++----+-++-+++++++- 3---+V+++--V+----V---+- 4+-+-+-V-V-V-++++++++++-

5+-++----+--++-++-+-++-

1. Stenotrophomonas maltophilia (嗜麦芽糖

寡养单胞菌) ATCC51331

2.Enterobacter cloacae (阴沟肠杆菌) ATCC13047 3.Proteus mirabilis (奇异变形杆菌) ATCC35659 4.Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae (肺炎克雷伯菌) ATCC35657

5.Escherichia coli (大肠埃希氏菌) ATCC25922

ATCC: American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.

Profile obtained after 24-48 hours of incubation for the strain ATCC 51331, using cultures grown on Trypcase Soy agar + blood

Profile obtain after 18-24 hours of incubation for the other strains, using cultures grown on Trypcase Soy agar + blood

Bacterial suspension prepared in NaCl 0.85% Medium

API 20 E 生化反应表

试验底物反应/酶结 果 阴性阳性

ONPG邻硝基苯-半乳糖苷 b-半乳糖苷酶 无色黄（1） ADH精氨酸 精氨酸双水介酶 黄色 红/橙色(2) LDC 赖氨酸 赖氨酸脱羧酶 黄色 橙色 ODC 鸟氨酸 鸟氨酶脱羧 黄色 红/橙色(2)

CIT 柠檬酸钠 柠檬酸利用 淡绿/黄 兰绿/兰(3)

H2S 硫代硫酸钠 H2S产生 无色/微灰 黑色沉淀/细线 URE 脲素 脲酶 黄色 红/橙色

TDA 色氨酸 色氨酸脱氨酶 (TDA/立即) 黄色 深褐

IND 色氨酸 吲哚产生 (James试剂/立即或IND吲哚/2分钟) James 无色 淡绿/黄 IND

黄色 James 粉红

IND 红色环

VP 丙酮酸盐 3-羟基丁酮产生

乙酰甲基甲醇(VP 1 + 2 / 10分钟) 无色 粉红/红色

GEL Kohn明胶 明胶酶 黑色素不扩散 黑色素扩散 GLU 葡萄糖 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色 MAN 甘露醇 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色 INO 肌醇 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色 SOR 山梨醇 发酵/氧化(4) 兰/兰

绿 黄色

RHA 鼠李糖 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色 SAC 蔗糖 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色 MEL密二糖 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色 AMY 苦杏仁苷 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色 ARA 阿拉伯糖 发酵/氧化(4) 兰/兰绿 黄色 OX 在滤纸上 细胞色素氧化酶 (OX / 1 - 2分钟) 无色 红色

NO3 - NO2 葡萄糖管 NO2产生还原到N2 (Nit 1+2 / 2-3分钟) 黄色紫色

(Zn / 5分钟) 红色 黄色

MOB API M或显微观察 运动性 不运动 运动 MaC MacConkey培养基 生长 无 有 OF-F

OF-O 葡萄糖

(API OF) 发酵: 石腊油覆盖 氧化: 和空气接触 绿 绿 黄 黄

(1) 淡黄可考虑为阳性。

(2) 培养18-24小时後,橙色应判断为阴性。 (3) 在顶部判读(需氧)。

(4) 发酵始於管的下部，氧化始於管的上部。 (5) 10分钟後如出现淡粉红应判断为阴性。

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