HPLC-UV-CL联用研究霍山石斛生物碱清除自由基活性
陈乃东1,2,3,李 俊3,*,金 晖1,陈 琼1,朱庆杰1
【摘 要】目的:霍山石斛生物碱抗氧化活性成分在线测定,为霍山石斛药效物质基础研究及抗氧化活性物质快速发现提供依据;方法:在预实验基础上建立霍山石斛生物碱部位HPLC-UV分析方法,采用鲁米诺-双氧水发光体系作为羟自由基供体、以校正清除率为抗氧化活性评价标准,HPLC-UV-CL联用在线测定霍山石斛生物碱部位各组分清除羟自由基活性。以磷钼酸、碘-碘化钾为沉淀试剂敲出总生物碱提取物中生物碱组份,对比敲出前后HPLC图谱变化,确定霍山石斛的生物碱组分。结果:在本实验条件下,霍山石斛中检出4种生物碱峰6、峰10、峰11、峰14,其中峰14、峰11具有一定的清除羟自由基活性,校正清除率达4.95%和10.94%。峰6、峰10对鲁米诺-双氧水系统发光值无明显影响。结论:HPLC-UV-CL可用于霍山石斛生物碱清除自由基活性快速测定。 【期刊名称】食品工业科技 【年(卷),期】2015(036)007 【总页数】5
【关键词】霍山石斛,高效液相-化学发光联用,清除羟自由基活性,生物碱 3.School of Pharmacy,Anhui Medical University,Hefei 230032,China) 霍山石斛(Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng),俗称米斛,为兰科石斛属多年生草本植物,局限分布于大别山区的安徽霍山、金寨、岳西、舒城,湖北英山等县,含有多糖[1]、生物碱[2]和黄酮[3]等,具有增强免疫活性[4-5]、明目、抗氧化等功效[6],为安徽道地药材之一。
大量研究表明中药的许多功效与其抗氧化作用密切相关[7-8],快速发现中药中抗
氧化活性成分对于阐明中药的作用机制和中药新药创制具有重要意义。传统中药活性物质的发现多采用先分离得到的单一化合物再进行活性测定的方式,然而,这种先分离再测定活性的方法盲目性较大,研究成果的取得带有很大的偶然性,效率极为低下。针对上述弊端,本实验拟从霍山石斛抗氧化活性入手,采用HPLC-UV-CL联用对霍山石斛总生物碱提取物抗氧化活性在线测定以快速发现霍山石斛中存在的抗氧化活性物质,为后续的抗氧化活性物质的定向分离、霍山石斛的谱效关系及临床应用提供理论依据,为探讨新的中药质量评价模式提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
实验材料霍山石斛,2013年10月采自安徽霍山,品种经植物细胞工程安徽省工程技术研究中心陈乃富教授鉴定为霍山石斛(Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng)。
甲醇 AR,上海振兴化工一厂;色谱甲醇 上海星可生化有限公司;色谱乙腈 上海星可生化有限公司;磷酸 上海振起化学试剂有限公司;二乙胺 汕头市西陇化工厂有限公司;二氯甲烷,三氯甲烷 西陇化工股份有限公司;磷钼酸,雷氏铵盐,碘化钾 国药集团化学试剂有限公司;碘化汞钾 贵州铜仁化学试剂厂出品。
高效液相色谱仪:Waters1525 HPLC色谱仪(Breeze工作站、Waters2487双通道紫外检测器,美国);化学发光仪 西安瑞迈。 1.2 实验方法
1.2.1 样品的制备 60℃烘干至恒重的霍山石斛,粉碎,精密称取10.0g,放入圆底烧瓶中,加入95%甲醇溶液50mL,60℃水浴冷凝回流浸提3次,每次3h,合并滤液,减压浓缩至干,残渣溶于5%的盐酸溶液,等体积二氯甲烷萃取3次,酸水相加
氨水调pH至10.0,等体积氯仿萃取3遍,回收氯仿获总生物碱提取物,溶于色谱甲醇配成2.5mg/mL溶液,0.45μm微孔滤膜过滤、备用。
1.2.2 HPLC-UV-CL在线分析中HPLC条件 参照相关文献[9],经过反复预实验,确定霍山石斛总生物碱HPLC检测条件为:Kromasil ODS C18柱;流动相0.02mol/L二乙胺溶液(A相)-乙腈(B相),梯度洗脱,0～8.0min,20% B,8.0～10.0min,20%～30% B,10.0～17.0min,30% B,17.0～30.0,30%～45% B,30.0～33.0min,45%～50%,33.0～40.0min,50% B,40.0～42.0min,50%～65% B,42.0～48.0min,65% B,48.0～50.0min,65%～80% B,50.0～57.0min,80% B,57.0～60.0min,80%～100% B,60.0～73.0min,100% B,73.0～76.0min,100%～20% B,76.0～86.0min,20% B,流速0.6mL/min;检测波长240nm;柱温25℃;进样量20μL。
1.2.3 HPLC-UV-CL在线分析中CL条件 参考余伯阳[10-12]、李萍[13]等方法,在前期实验基础上[14],采用鲁米诺-双氧水发光体系在线评价霍山石斛生物碱部位清除羟自由基活性。主要测定条件如下:
碳酸盐缓冲液:0.1mol·L-1 NaHCO3水溶液以0.1mol·L-1 Na2CO3碳酸钠水溶液调pH至10.0,0.45μm微孔滤膜过滤、备用。
H2O2溶液:精密量取30% H2O2溶液加双蒸水稀释成1.0×10-5mol/L的H2O2溶液0.45μm微孔滤膜过滤、备用。
鲁米诺溶液:精密称取鲁米诺碳酸盐缓冲液稀配制成1.8×10-5mol/L鲁米诺溶液,0.45μm微孔滤膜过滤、备用。 以双蒸水为空白对照。
1.2.4 抗氧化活性计算方法 在丁晓萍等[10]方法的基础上,实验采用校正清除率
HPLC-UV-CL联用研究霍山石斛生物碱清除自由基活性
