19. 在Threshold 窗口，适当地提高FSC阈值>52，以去除碎片或低阶噪音。唯需注意不要切掉主要细胞族群。
20. 点击Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去阴性对照管，关闭Detector/Amps、Threshold窗口，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。
说明：最适化的最后一步是调节光谱重迭。（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是2色样本，必要时需调节FL2-%FL1，FL1-%FL2（若3色样本，必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿）。
调节荧光补偿
21. High RUN，换上单染CD3-FITC管。点击Acquisition Control窗口中的Acquire。调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。补偿调节可通过点击??来选择或直接拖动滑标上下移动。调节完毕，点击Acquisition Control窗口中的Pause。
22. 移去单染CD3，换上单染CD19-PE管。点击Acquisition Control窗口中的Restart。调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。调节完毕，点击Acquisition Control窗口中的Pause。
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23. 最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机，点击Acquisition Control窗口中的Restart，确定三群细胞工整垂直。当您已完成2色荧光之光谱重迭时，点击Acquisition Control窗口中的Pause、Abort。
24. 移去样本管，换上dH2O管，让仪器暂且处于Standby状态。关闭Compensation窗口。您已完成2色荧光之最适化。
25. 预设之「储存细胞总数」为10000。如需修改，从Acquire菜单中选择Acquisition & Storage，并在出现的窗口功，确认「Collection Criteria」从10000 of All，再点击OK。
3.4收集实验数据 决定储存细胞总数
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26. 找个档案匣准备储存数据。从Acquire 菜单中选择Parameter Description，出现Parameter Description对话方框。点击Folder，并在随后出现之对话方框，选择「Your Folder」或新建活页夹，点击此对话方框的Select ‘Your Folder‘。
27. 命名即将储存之文件名：点击Parameter Description对话方框的File，出现文件名编辑窗口。在Custom Prefix中：输入文件名20031231，点击此对话方框的OK。日期为最常用之文件名系统。
28. Optional：如有需要，可选择或在P1-P5后的空格中输入相关参数名。如P1：Size, P2：Granularity, P3：CD3 FITC。输入参数名会存入实验档案中，显示在图谱上。
29. 从Acquire 菜单中选择Counters. 窗口会显示样品分析速率、与总数进度。
计数器Counters
收集实验数据
30. 你可以开始收集实验数据了。HIGH RUN，将第一管样品放到检测区，在Acquisition Control窗口中，将 ? Setup 改成 ? Setup，此时CellQuest会自动显示 Your Folder：20031231.001为资料文件名。点击“Acquire‖ 便可启动样品之分析测定与数据储存。当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据文件20031231.001，并会以“嘟”声告知，CellQuest会自动升幂附加档名成20031231.002。等待下一指示。
31. 你可以换上下一管样品，点击“Acquire‖ 启动样品之分析测定与数据储存。可继续分析直到所有检品都分析完毕。
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3.5实验数据之储存与备份：
32. 不建议长期使用硬盘储存数据数据，可考虑以烧光盘（如配有 CD-RW）、口袋硬盘（Flash Drive）来备份大量实验数据，以免占用原有硬盘的内存，影响数据处理速度。可将备份后之数据，拿到另一苹果计算机或个人PC进行离机分析。
33. 确认所有档案皆己备份后，以鼠标圈选欲删除数据，将其拖拉至Trash筒。
34. 检品分析完毕后，记得从屏幕上方 File 指令栏选择 Save As，储存实验文件，以备日后使用，不需每次重新编辑。
退出软件
35. 从屏幕上方 Cytometer 指令栏，选择Instrument Setting，出现Instrument
Setting窗口。点系print打印此次实验条件，可贴入实验笔记留底，再点击Save以储存此一实验的仪器条件，供日后再使用。点系SAVE后会出现文件保存对话方框，选择文件目录及文件名（例：Your Folder：/Your Setting1），点击Save。点击Done。
36. 检品分析完毕后，用鼠标从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取Disconnect to Cytometer 以断绝计算机与仪器间之联机。之后如不分析数据，您可退出软件“File”?“Quit”(遇有选项永远选择“Don?t save”)，进行关机程序。
37. 以2 ml 10％ 漂白水取代样品，将样品架置于左位以外管吸除约1 ml，再将样品架置于中位 HI RUN 十分钟。改用 2 ml DI water。重复上述程序，样品架上留约 1 ml DI water 。按STANDBY五分钟。
管路清洗
关主机、关计算机
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四、数据分析
FCS list mode数据文件：
说明：FCS list mode数据文件是流式细胞仪的标准格式档案（FCS2.0）。该文件含有从流式细胞仪收取的平均10,000个细胞数的资料，含有4~6个参数。一般软件无法打开list mode数据文件，需藉助如CellQuest, WinList, WinMDI, 等Flow 分析软件，才可开启、绘图、并进行分析统计。
1. 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出现一‘Untitled‘ 实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。
2. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，然后拖动对角线至适当大小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot对话框。
4.1 开启一CellQuest实验文件
4.2散点图之统计分析（双色）
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BD FACSCalibur流式细胞仪操作手册
