BD FACSCalibur流式细胞仪
FACS101 Handbook
本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报www.bdtwn.com.tw/bdb/index.html。 如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载 www.bdtwn.com.tw/bdb/10-5-3-1.html 。 如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载 www.bdtwn.com.tw/bdb/10-5-4-1.html 。
一、BD FACSCalibur基本结构
1.1仪器本体： 1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。
2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射
以BD FACSCalibur 基本型为例 ? ? ? ? ?
FSC Diode 只收488 nm波长散射光 SSC PMT 只收488 nm波长散射光
FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）
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3. 仪器面板：
仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制：
LO： 样品流速：12 ?l /min MED：样品流速：35 ?l /min HI: 样品流速：60 ?l /min
功能控制：
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RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。）
STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。
PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。
4. 储液箱抽屉：
在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。
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? 鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。
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废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。
鞘液过滤器：0.22?m过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。
气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。
空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。
5. 上样品区：
上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针 Sample Injection Tube，将样本输入流动室，还有就是支撑架 Tube Support Arm、和液滴存留系统 Droplet Containment System。
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进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。
支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。
液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。
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1.2 Macintosh计算机与打印机：
准备您的细胞样品 1. 理想样品浓度调至1-10 X 105 cells/ml？一般实验只需0.5 ml的样品。
2. 细胞样品务必放至BD FALCON 352052 试管中，否则无法上机。
3. 上机前务必去除样品中之细胞团块，以防止管路堵塞？可使用附滤网BD
FALCON试管 (Cat. No.352235) 或35-55 ?m的尼龙筛网。
4. 供流式分析的样品是单细胞悬浮液，而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原
荧光染色的方法大致有两种：直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。研究生可至本公司网站下载染色方法 http://www.bdtwn.com.tw/bdb/10-5-4-1.html
? 直接免疫荧光染色
? Lysed - No - Wash Procedure
? Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27 ? Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure ? Leukemia and Lymphoma Procedure 1
? Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay ? 间接免疫荧光染色 ? 滴定抗体浓度 ? 常用试剂
5. 如因特殊因素无法下载上述实验方法，请e-mail：yenchichen@bdtwn.com.tw或 austin_bdtwn@yahoo.com.tw。
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二、开机、关机标准操作
2.1 FACS Calibur 开机 1. 开启细胞仪电源。
2. 开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。 3. 开启计算机。
4. 确认鞘流液筒有八分满的FACS Flow，确实旋紧 (鞘液筒容量为4L)。 5. 将废液倒掉，并在废液筒中加入200 ml 家用漂白水 (废液筒容量为4L)。 6. 将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。 7. 排除液流管路与过滤器中的气泡。 8. 取下样品管，执行 PRIME 功能两次。 9. 使用1ml PBS，HIGH RUN 两分钟。 10. 可开始分析样品。
2.2 FACS Calibur 关机
关机前必要动作：清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。
1. 将样品支持架左移，取 2 ml FACSClean（10%Bleach）上样品，让仪器的真
空系统抽取约 1 ml 的液体。
2. 将样品支持架回正，按 HI RUN，然后让 FACSClean 清洗管路10分钟。 3. 按 Standby，取下样品管，执行 PRIME功能两次。 4. 取 2 ml dH2O，重复上述步骤1-3。 5. 注意最后只留约 1 ml dH2O 在试管中。
6. 按 STANDBY 五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作，以保护
雷射光源。）
7. 倒掉废液，并回填 200 ml漂白水。
8. 将减压阀放在「VENT 漏气」位置。将鞘流液筒充填至八分满。
9. 退出软件“File”?“Quit”(如有对话选项，选择“Don?t save”)。确认退出
计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。 10. 关闭计算机。“Special”?“Shutdown”。
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BD FACSCalibur流式细胞仪操作手册
