三、提高分子标记的筛选效率 (一)多重PCR方法
为了增加标记的筛选效率，当同时筛选到与2个或2个以上目标性状连锁的几个不同的分子标记时，如果这几个分子标记的扩增产物具有不同长度，则一对以上的引物可在同一PCR条件下同时反应，这称为多重扩增。利用这种方法时需注意，设计或选择引物时，必须考虑各引物复性温度是否相匹配，且在扩增产物的大小上无重叠。研究表明，多重扩增使用Taq酶量与一个引物扩增用量相同。这显著地降低了选择成本费用和筛选时间。如Ribaut等将筛选到的与热带玉米抗旱基因QTL连锁的1个STS，2个SSR标记使用多重扩增方法用于MAS选择，以改良其耐旱性，两人仅用了一个月就从BC2F1的2300个单株中选出300个目标单株。
(二)用相斥相分子标记进行育种选择
所谓相斥相分子标记指与目标性状相斥连锁的分子标记，即有分子标记，植株不表现目标性状；无分子标记，植株表现目标性状。这些选择特别在一些显性标记如RAPD标记中，效果较为显著。Haley等(1994)找到与菜豆普通花叶病毒隐性抗病基因bc—3连锁的两个RAPD标记，其中标记—1与bc—3相引，距离为1．9cM；标记—2与bc—3相斥，距离为7．1cM。用标记—1选择的纯合抗病株、杂合体、纯合感病株分别占26．3％，72．5％和1．2％。而用标记—2选择的结果分别是81．8％，18．2％和0。当将两个标记同时使用时，即相当于一个共显性标记。其选择效果与单独使用标记—2的选择效果一致。一般认为，在育种早代选择中，利用相斥相的RAPD标记，与共显性的RFLP标记具有相似的选择效果。 (三)克服连锁累赘
回交育种是作物育种常用的育种方法，但回交育种中长期存在的问题是在回交过程中，目的基因与其附近的非目的基因存在连锁，一起导人受体，这种现象称为连锁累赘(Linkage drag)。利用与目标性状紧密连锁的分子标记进行辅助选择可以显著地减轻连锁累赘的程度。如在大约150个回交后代中，至少有一个植株在其目的基因左侧或右侧lcM范围内发生一次交换的可能性为95％，利用RFLP标记可以精确地选择出这些个体；在另一个有300个植株的回交群体中，有95％的可能在被选择基因另一侧lcM范围内发生一次交换，从而产生目的基因大于2cM的
片段。这个结果用RFLP选择只需2个世代就能够得到；而传统的方法可能平均需要100代。随着分子标记图谱的更加密集，选择重组个体的效率将进一步提高。因此，高密度的作物分子遗传图谱的构建是加速作物育种进程所必需的。 (四)降低MAS育种的成本
进行MAS，首先是需把与目标基因(性状)紧密连锁(或共分离)的分子标记如RFLP、RAPD等转化为PCR检测的标记。然后设法降低PCR筛选成本。可从以下几方面考虑：
①样品DNA提取。采用微量提取法如利用小量组织或半粒种子且不需液氮处理的DNA提取技术。且在提取过程中不利用特殊化学药品，降低提取缓冲液成本。
②减少PCR反应时的体积。如反应时的体积从25μ1减到15μ1甚至10μ1。
③琼脂糖(Agrose)凝胶：实验表明同一Agrose胶可以多次电泳载样，而不会造成样品间互相干扰。
④扩增产物检测：通常PCR扩增产物用EB染色，LTV观测，使用Polaroid film照相系统。利用这种观测方法，不仅有致癌诱导剂，而且UV射线对眼睛损害很大，照相系统花费也很高。通过改造染色系统，利用美蓝又称亚甲蓝、甲烯蓝(Methylene blue)染琼脂糖凝胶，可直接在
可见光下检测。甚至若PCR扩增产物仅一种，则无需电泳，只需在反应管中加入EB，紫外灯下直接根据反应即可鉴定出目标基因型，大大降低了标记辅助选择成本，非常有利于大规模育种。这在中国春小麦Phlb基因的SCAR标记筛选上已有成功尝试。
近十年多来，分子标记的研究已经得到快速发展，在许多作物中已定位了很多重要性状的基因，但育成品系或品种的报道还相对较少。究其原因主要有：①标记信息的丢失。标记仍然存在，但由于重组使标记与基因分离，导致选择偏离方向；②QTL定位和效应估算的不精确性；③上位性的存在，由于QTL与环境、QTL与QTL间存在互作，导致不同环境、不同背景下选择效率发生偏差；④标记鉴定技术有待进一步提高。尽管近年来标记鉴定技术在实用性及降低成本方面都得到了很大发展，但对于大多数实验室来说，MAS还是一项费时耗资的工作。尽管目前MAS的成功应用还存在诸多困难，但MAS在未来作物育种中的作用是毋庸置疑的。相信在不久的将来，随着分子生物技术的进一步发展以及各种作物图谱的日趋饱和，MAS会发挥它应有的作用。
分子标记辅助选择育种 - 图文
