第十七章 分子标记辅助选择育种
传统的育种主要依赖于植株的表现型选择(Phenotypieal selection)。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。
育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择(molecular marker-as—sisted selection，MAS)育种更受到人们的重视。
第一节 分子标记的类型和作用原理
一、分子标记的类型和特点
按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling)、延伸(exten—sion)三步(图17—1)。变性指的是通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程；复性(又称退火)是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链；延伸是指在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的5'-3'的DNA链延伸。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经25～30个循环后，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2×106-7拷贝。按照PCR所需引物类型又可分为：①单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩增多态性DNA标记(Random别
amplification polymorphism DNA，RAPD)、简单重复序列中间区域标记(1nter-simple sequence repeats polymorphisms，ISSR)等技术；②双引物选择性扩增的PCR标记，主要通过引物3'端碱基的变化获得多态性，这种标记主要指扩增片段长度多态性标记(Amplified fragment lengthpolymorphisms，AFLP)；③需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记如简单序列重复标记(Simple sequence repeats，SSR)、序列特征化扩增区域(Segion，简称SCAR技术)和序标位(Sequence—tagged sites，简称STS)等。第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。表达序列标签(Expressed sequences tags，EST)是在cDNA文库中随机挑选克隆，并进行单边测序(Singlepass sequence)而产生的300～500bp的核苷酸片段。
应用于分子标记辅助育种的标记主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。它们的遗传、表现特点总结于表17—1。
分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不是太高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。 二、分子标记的原理和遗传特性
(一)RFLP
发现最早，目前应用最为广泛的一种分子标记。这一类标记在20世纪70年代已被发现。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。目前，该技术已广泛用于动植物连锁图的构建、重要农艺性状基因的分子标记等。
1．RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的碱基替换、插人、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNA／RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，
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