细胞培养的基本方法-细胞分离技术

细胞培养的基本方法-细胞分离技术

细胞分离技术

一、从原代组织中分离细胞 将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机

械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。

从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。

1. 胰蛋白酶（Trypsin）

?在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成

3~4mn小片，通过悬

2到3

浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗 次。

?将盛有组织碎片的容器置于冰上，

去除残留的上清液。 加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐

溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。

?在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 ?移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片 ?在组织碎片加入热的完全培养基， 加入大豆胰蛋白酶抑制剂。

?通过无菌不锈钢丝网（100?200mm过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培 养。

20到30分钟。

用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要

2. 胶原酶（Collagenase）

?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成 几次。

?加入胶原酶（50?200单位/ml，溶解在HBSS中）。 ?在37C孵育4到18小时。加入3mM CaCI2增加解离效率。

?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。 如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 ?通过离心在HBSS中清洗悬液几次。

?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片

3. Dis pase

?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成 几次。

?加入Dispase （0.6?2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液） ?在37C孵育20分钟到几个小时。

?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。 如果需要进一步的

3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片

解聚，在碎片中加入新鲜的

?通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。

Dispase。

?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

二、从原培养容器中分离细胞：以下是从基层迅速分离细胞，且保持细胞完整性的一般步骤。 这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用， 每一种系统最佳条件和施用浓度应该根据 经验加以确定。 ?再次培养时检测细胞的活性。 ?细胞的活率应该超过 90%

?对于无血清培养基，降低胰蛋白酶使用量。

1. 移弃使用过的细胞培养基。 2.

（ethylene diamine tetraacetic acid

使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或 ，乙二胺

EDTA

四乙酸?）清洗细胞（看表确定正确的清洗溶液）

。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液，

通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层，然后去除清洗液。

3.以2?3ml/25cm2的量，加选择的分离液（见表）到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆 盖细胞层。在37C孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶。通常，在

层分离的细胞系，可以轻轻敲打，以加速分离过程。

5到15分钟内，细胞就会脱落。

细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。 对难于从培养瓶基

4. 当细胞完全分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全 培养基，通过移液

管在单层细胞表面反复吹打来分散细胞。计数并再次培养细胞。

5.

抑制剂。通常使用

白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。

对于无血清培养基，加入大豆胰蛋白酶1 : 1（V : v） 0.25mg/ml胰蛋

第三节细胞的冻存与复苏 为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变

异，有时因寄赠、交换和购买，

培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是

现简要介绍深低温保存法

在一70C以下时，细胞内的酶活

在于通过

进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。

（—70C196C）的特点。细胞深低温保存的基本原理是：

性均己停止，即代谢处于完全停止状态，

故可以长期保存。细胞低温保存的关键，

0~20C阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

一、细胞的冻存：为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系 的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。

有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下: ?包含10%甘油的完全培养基，

?包含10%二甲基亚砜（DMSO的完全培养基，

? 50%细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基，或

? 50% 细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚砜的新鲜培养基。

对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：

? 50%细胞条件无血清培养基和 50%包含有7.5 %二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或 ?包含有7.5 %二甲

基亚砜和10%细胞培养级 BSA的新鲜无血清培养基。

1. 悬浮细胞

?计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约 胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。

?以1X 107到5X 107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以 0.5 X 107到

200?400g离心5分钟沉淀细

1X 107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。

?分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入 4C冰箱中， 冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

5分钟内开始冷冻步骤。

?细胞以1 C /分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到 -70C到-90C的

2. 贴壁细胞

?使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。 ?在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。

?以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。 ?以5X 106到1X 106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。 ?分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入 4C冰箱中， 冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

二、冻存细胞的复苏：冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完 全生长培养基中。若细胞对冻存剂（ 完全生长培养基中。

5分钟内开始冷冻步骤。

?细胞以1 C /分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到 -70C到-90C的

DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入

1. 直接铺板方法

?取出贮存细胞，37 C水浴中快速融化。 ?直接用完全生长培养基铺板细胞。

1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细

胞计数，细胞接种应该至少在3X 105活细胞/ml。

?培养细胞12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。

2. 离心方法

?取出贮存细胞，37 C水浴中快速融化。

?把1到2ml冻存细胞加入到大约 25ml完全生长培养基，轻轻混匀。 ?以大约80X g离心2到3分钟。 ?弃去上清。

?在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。 ?细胞铺板，细胞接种应该至少为3X 105活细胞/ml。

三、细胞的分化、衰老与死亡