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桂芍散结丸质量标准研究
杜毅(副主管药师,市中医医院，周村新建中路75号，255300)
摘 要 目的：建立桂芍散结丸的质量标准，为医院制剂的质量控制提供依据。方法：采用显微鉴别法，对方中红花、黄柏药材进行了定性鉴别；采用薄层色谱法（TLC），对赤芍、王不留行、醋延索、黄柏药材进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC），测定赤芍中芍药苷的含量。结果：显微鉴别粉末特征典型；薄层色谱专属性强，阴性对照无干扰；芍药苷的进样量在0.2739～3.4241μg围与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999），平均加样回收率为95.62%，RSD为1.11%（n=6）。 结论：所建标准可用于桂芍散结丸的质量控制。 关键词 桂芍散结丸；薄层色谱鉴别；含量测定；质量标准
桂芍散结丸是我院中药自制制剂，由王不留行、红花、赤芍、黄柏、醋延索、醋山甲、肉桂等14味药材组成。具有活血散结、通利尿道、清热解毒的功效。用于前列腺增生症，小便不利，男科生殖器官炎症，疗效确切。为了有效控制本制剂质量，保证临床疗效，笔者对方中的红花、黄柏进行了显微鉴别，对王不留行、赤芍、醋延索、黄柏药材进行了薄层色谱鉴别，并用高效液相法测定赤芍中芍药苷的含量。 1 仪器与试药
奥林巴斯BX53型生物显微镜；GOODLOOK-1000薄层色谱成像系统；岛津LC-20A高效液相色谱仪；MS205DU梅特勒电子天平；KS-500EI超声波清洗机；真空脱气器；DP-01无油真空泵。
芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，110736-201337）；王不留行对照药材（中国食品药品检定研究院，121094-201305）；延索乙素对照品（中国食品药品检定研究院，110726-201414）；盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，110713-201212）；桂芍散结丸供试品（批号141011、141111、141212）及其相应阴性样品均由市中医医院提供；硅胶G薄层板（Merck公司）；乙腈（天津科密欧，色谱纯）；甲醇（天津康科德，色谱纯）；磷酸（安谱科学仪器，色谱纯）；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 显微鉴别
取本品粉末，置显微镜下观察：黄柏纤维鲜黄色，直径16～38μm，周围细胞含草酸
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钙方晶，形成晶鞘纤维；含晶细胞壁木化增厚（1）。红花花粉粒类圆形、椭圆形或橄榄形，直径约至60μm，具3个萌发孔，外壁有齿状突起（2）。结果见图1。
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图1 黄柏、红花显微鉴别
2.2 薄层色谱鉴别【1】 2.2.1 赤芍薄层色谱鉴别
取本品10g，加甲醇50ml，超声20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱（100-200目,5g,径1cm）上，用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取按处方比例和工艺制备不含赤芍的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。再取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(（2015版药典通则0502）)试验【2】，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。结果见图2。
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图2 赤芍薄层色谱图
2.2.2 王不留行薄层色谱鉴别
取本品10g，研细，加70％甲醇25ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至约10ml，作为供试品溶液。另取按处方比例和工艺制备不含王不留行的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。再取王不留行对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-水(4∶6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。结果见图3。
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图3 王不留行薄层色谱图
2.2.3 醋延索薄层色谱鉴别
取本品10g，研细，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取按处方比例和工艺制备不含醋延索的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。再取延索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(9∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。结果见图4。
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图4 醋延索薄层色谱图
2.2.4 黄柏薄层色谱鉴别
取本品10g，研细，加浓氨试液2ml，甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml作为供试品溶液。另取按处方比例和工艺制备不含黄柏的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验【3】，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－浓氨试液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。结果见图5。
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图5 黄柏薄层色谱图
2.3 赤芍中芍药苷的HPLC法含量测定 2.3.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：岛津Inertsil ODS-SP C18 5um，150×4.6mm；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.1％磷酸溶液(14：86)；流速：1.0ml/min；检测波长：230nm；柱温：30℃；进样量：10ul；在此色谱条件下，供试品中芍药苷色谱峰的峰型较好，与其他组分峰能达到基线分离，芍药苷保留时间为10.475min。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。 2.3.2 溶液制备
供试品溶液制备： 取本品适量，研细，约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率240W，频率40kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液制备： 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含136.9651 ug的溶液，即得。
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阴性对照品溶液制备：按照桂芍散结丸的制备工艺，制备不含赤芍的样品，并按“2.3.2”项下“供试品溶液制备”方法制成阴性对照溶液。 2.3.3 专属性试验
分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液以及阴性对照溶液各10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样检测。供试品色谱中，在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，阴性对照色谱在与芍药苷对照品色谱相同的保留时间处，无色谱峰干扰。结果见图6.
A
B
C
图6专属性色谱图
A.芍药苷对照品 B. 供试品 C. 阴性对照
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2.3.4 线性关系考察
精密称取芍药苷对照品（批号：110736-201337）17.76mg(芍药苷含量96.4%)，置50ml容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为342.4128ug/ml的对照品溶液，作为贮备液。从贮备液中分别精密量取2ml、1ml、1ml、2ml、5ml，分别置25ml、10ml、5ml、5ml、10ml的量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为27.3930ug/ml 、34.2413ug/ml、68.4826ug/ml 、136.9651ug/ml、171.2064ug/ml的对照品溶液。
分别精密吸取上述芍药苷对照品溶液各10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。以芍药苷对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为Y=1445469.47X-35220.60（R=0.9999）。结果表明，芍药苷进样量在0.2739～3.4241μg围与其峰面积呈良好的线性关系。 2.3.5 仪器精密度试验
精密吸取芍药苷对照品溶液（136.9651ug/ml）10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，连续进样6次。结果， RSD=0.225%（n=6），显示仪器精密度良好。 2.3.6 稳定性试验
取同一供试品溶液适量（批号：141212），按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，每隔1小时进样一次，连续考察6小时。结果，RSD=0.382%（n=6），表明供试品溶液在6小时稳定。
2.3.7 重复性试验
取同一批的本制剂（批号：141212）6份，照“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。结果，样品平均含量为1.6652 mg/g，RSD=0.40%（n=6），表明方法重复性良好。 2.3.8 加样回收试验
取已测知含量的本制剂适量（批号：141212，芍药苷含量为1.6652mg/g），研细，取约1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入“2.3.5”项下芍药苷对照品储备液（浓度为342.4128ug/ml）7ml及稀乙醇共计50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率240W，频率40kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。平行制备6份。
分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。试验结果表明，本方法加样回收率良好。见表1。
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表1 加样回收率试验结果（n=6）
取样量
（g）
1.2015 1.2012 1.2012
（mg） 2.0007 2.0002 2.0002
量（mg） 2.3969 2.3969 2.3969 2.3969 2.3969 2.3969
（mg） 4.2552 4.2642 4.3052 4.3058 4.3087 4.3099
（%） 94.06 94.46 96.16 96.21 96.36 96.44
95.62
1.11
（%）
（%）
样品中含量
对照品加入
测得量
回收率
平均
RSD
1.2009 1.9997 1.2005 1.9991 1.2001
2.3.9 样品含量测定
1.9984
取3批桂芍散结丸样品（批号141212、141111、141011），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，计算样品含量，每批测定2次。结果,3批样品中芍药苷含量分别为1.6639 mg/g、1.4216 mg/g、1.4188 mg/g。见表2。
表2样品含量测定结果
批号 141212 141111 141011
含量1（mg/g）
1.6636 1.4229 1.4193
含量2（mg/g）
1.6642 1.4204 1.4183
3 讨论
桂芍散结丸所含的药味较多，除本实验已经鉴别的药味外，还进行了其他药味的薄层色谱鉴别研究。穿山甲在本制剂处方组成中占量较少，薄层色谱鉴别时供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点但不清晰，未列入质量标准。红花薄层色谱鉴别，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，但是斑点色泽不鲜明，故未作为质量标准。
含量测定试验中对不同取样量（2g、3g、4g）进行了考察，结果分别为1.6554mg/g、1.6632mg/g、1.6713mg/g，显示三种取样量结果差异不大，确定取样量为3g。对不同提取方法（超声30min、加热回流30 min、加热回流1h）进行了比较研究，结果显示芍药苷超声提取30min即可提取完全并且快速、简便、节约能源。
平均含量（mg/g）
1.6639 1.4216 1.4188
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桂芍散结丸是由中药饮片粉碎后的细粉经加工制成的水丸，在1000g的桂芍散结丸中含赤芍生药90g。根据2015年版一部“赤芍”项下规定，芍药苷的含量限度为“不得少于1.5%”，由此计算理论含量应为1.35mg/g，参考生粉入药其有效成分的转移率为90%这一原则，结合三批样品的含量测定结果，暂定本品每g含赤芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于1.20mg。 参考文献
【1】 药典委员会.中华人民国药典（四部）【S】.：中国医药科技，2015.
【2】 德世，鲁建武.祛风消痛颗粒的薄层色谱鉴别【J】.中国医院药学杂志，2007,27
（10）：1472-1473
【3】 立新，王锦玉.牛黄上清微丸定性及定量分析【J】.中国实验方剂学杂志，2010,16
（16）：69-70
作者简介
杜毅，男，人，副主管药师，研究方向：中药鉴定、中药制剂、中药质量控制。
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