DNA发夹结构自组装信号放大策略应用的研究进展
俞 蓓1，陈时建2，徐天雄1，占忠旭1，赖卫华1，许恒毅1*
【摘 要】DNA发夹结构自组装因具有无酶参与、等温以及识别序列能力强等优点，在生物分子和金属离子检测方面展现了良好的发展前景。该文梳理了DNA发夹结构自组装信号放大策略的类型，综述了近年来该策略在致病菌、核酸肿瘤标记物、蛋白质、无机金属离子，以及生物小分子检测中应用的研究进展，并对其未来发展趋势进行了展望，旨在为基于DNA发夹结构自组装检测生物分子提供一定的参考。 【期刊名称】分析测试学报 【年(卷),期】2018(037)012 【总页数】7
【关键词】DNA结构自组装；分析检测；研究进展 修回日期：2018-07-30
基金项目：江西省青年科学家(井冈之星)培养对象项目(2014BCB23004)；江西省食品药品监督管理局科技计划(2015SP13)
基于核酸的检测技术因其高特异性和灵敏度被广泛用于生物小分子、无机金属离子、核酸和蛋白质分子的分析检测，然而实际样品中的被检物往往痕量，核酸探针与靶标物间通常以1∶1的比例结合，导致传统利用功能核酸链检测靶物的技术受到限制。近几年，为进一步提高检测灵敏度，研究者建立了一系列基于核酸信号放大的检测方法，将目标物的识别转化为DNA的扩增。
根据酶的参与与否，信号放大方式可分为基于酶介导的信号放大和无酶介导的信号放大两类(图 1)。基于酶介导的信号放大主要通过酶的一些特殊功能对核酸
进行复制、剪接及修饰以实现对生物活性分子的检测，该策略可分为热循环放大型和等温扩增放大型[1]。其中，以聚合酶链式反应(PCR)为代表的热循环放大型技术作为核酸检测的“金标准”，可将靶标的量放大108～109倍以利于常规方法的检测[2]，但该方法需使用昂贵的仪器设备，且易出现交叉污染，从而造成假阴性或假阳性结果[3]。等温扩增放大型技术如链置换扩增(Strand displacement amplification，SDA)[4]、环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[5]、滚环复制(Rolling circle amplification，RCA)[6]和核酸外切酶Ⅲ酶切循环放大(Exonuclease Ⅲ-aided amplification)[7]等虽可进行恒温扩增，无需特殊加热设备，但该类方法所用酶的价格昂贵，保存时间较短，且酶活性易受环境影响。
相对于酶介导的信号放大，无酶介导的信号放大因操作简便、选择性多、反应稳定而在现代分析领域中被广泛关注。其中，基于DNA发夹结构自组装的信号放大技术因具有无需酶催化、常温下可发生反应、无需专业技术人员及扩增设备、检测特异性强以及灵敏度与PCR相当[8]等优点，近年来在生化、食品和临床等领域得到迅速发展。本文针对DNA发夹结构自组装信号放大方法在致病菌、核酸肿瘤标记物、蛋白质、无机金属离子及生物小分子检测中的应用进展进行综述，并对其未来发展趋势进行了展望。
1 DNA发夹结构自组装信号放大方式的分类
DNA发夹结构自组装反应无需酶催化，DNA链可通过吉布斯自由能或位形熵的驱动自行组装，实现信号级联放大的杂交反应。常用的DNA发夹结构自组装反应主要有杂交链式反应、催化发夹型DNA自组装反应和熵驱动催化反应。 1.1 杂交链式反应
杂交链式反应(Hybridization chain reaction，HCR)是一种无需酶催化，常温下发夹型探针即可被目标DNA链“激活”，并不断杂交产生一条带有切口的长DNA双链的信号放大方法[9]。其原理如图2所示，反应体系中两个发夹型探针H1和H2均由粘性末端(a/c*)、茎部区(b和b*的配对区)及环状区(c/a*)3部分构成。在无目标链存在的情况下，这两个发夹型探针均以茎环结构稳定存在；当目标链a*b*存在时，目标链中的a*b*与H1中粘性末端a和茎部b互补，在自由能的驱动下，目标链可与H1杂交，并打开H1的茎环结构，从而暴露出cb*序列；同样地，cb*与H2中粘性末端c*和茎部b互补，然后在自由能的驱动下，将H2的茎环结构打开，从而暴露出与目标链相同的a*b*序列，其可作为目标链继续打开H1的茎环结构，反应依次循环进行，产生带有切口的H1、H2交替互补杂交的长DNA双链。因为反应物的自由能高于生成物的自由能，因此在自由能的驱动下可自发进行该反应，以增强检测信号。 1.2 催化发夹型DNA自组装反应
催化发夹型DNA自组装反应(Catalyzed hairpin assembly，CHA)是在HCR基础上发展的一种新型的自由能驱动的发夹型DNA组装方式。与HCR不同，CHA反应中的目标链可被置换并引发下一轮反应，在整个反应中起类似催化剂的作用。根据放大方式不同，CHA可分为线性放大型和指数放大型两种[10]，线性放大型CHA中发夹型探针通常被目标链“激活”后依次进行自组装，并将目标链置换出来，生成稳定的线性双链DNA结构，置换出的目标链继续引发下一轮杂交反应，使检测信号得到循环放大[11](图3)；而指数放大型CHA中发夹型探针被目标DNA催化自组装生成中间物，该中间物又可“激活”下一轮发夹探针同步进行自组装[12]，从而使检测信号得到指数式放大。在CHA
DNA发夹结构自组装信号放大策略应用的研究进展
