PCR反应条件的优化
PCR条件的优化
PCR必需具备下述基本条件：模板核酸（DNA或RNA）、人工合成的寡核苷酸引物、合适的缓冲体系、合适的Mg2+浓度、三磷酸脱氧核苷酸、耐热DNA聚合酶、温度循环参数、其它因素如二甲基亚砜、甘油、石蜡油、明胶等。
1．模板核酸
?核酸标本来源广泛，可以从纯培养的细胞或微生物、临床标本（血、尿、粪便、体腔各液、嗽口水等）、犯罪现场标本（血斑、毛发、精斑等）和病理解剖标本（新鲜的或经甲醛固定石蜡包埋组织）以及考古标本中直接提取。等扩增核酸都需部分纯化，使核酸标本中不含DNA聚合酶抑制剂。
?PCR反应中模板加入一般为102~105拷贝的靶序列。扩增不同拷贝数的靶序列时，加入的含靶序列的DNA量亦不同。如真核rRNA基因有200~500拷贝，反应中仅需加入0.5~2ng人基因组DNA即可。
?以质粒DNA或染色体DNA为模板时的扩增最适条件是不同的。前者所需的酶量少,循环数少,温度不如染色体DNA要求严格。
?扩增靶序列的长度根据不同目的而不同。用于检测目的则扩增片段长度一般为500bp以内,以100~300bp为最好。用TaqDNA聚合酶在合适条件（较长延伸时间）下，可扩增长达10~20kb的片段。
2．引物
PCR扩增产物的大小是由特异引物限定的，因此引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。
?引物合成的质量：合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱嘌吟产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。引物不用时应存于–20℃保存。引物的设计原则：见引物的设计
???引物的用量：一般PCR反应中引物的终浓度为0.1~1umol/L，引物浓度过低则产物量降低；引物浓度过高会促进非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成，它们与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP,从而使靶序列的扩增量降低。
3．缓冲液
目前最为常用的缓冲体系为10~50mmol/L。Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3,△pKa值为–0.021/℃。因此,20 mmol/L Tris–HCI(pH8.3,20℃)在实际PCR中,pH变化于6.8~7.8之间。改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmol/L, pH8.9,有时会增加产量。反应混合液中50mmol/L以内的KCl有利于引物的退火, 50mmol/L NaCl或50mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH4+代K+,其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白(100μg/ml)或明胶(0.01%)或Tween20(0.05%~0.1%)有助于酶的稳定,反应中加入5 mmol/L的二巯苏糖醇(DTT)也有类似作用,尤其在扩增长片段(此时延伸时间长)时,加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。
4.Mg2+
?Mg是Taq DNA聚合酶活性所必需的，也影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，则酶催化非特异的扩增。
?PCR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基因均可与Mg2+结合，降低Mg2+
浓度，而Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。因此，PCR中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.2~2.5m mol/L。最好对每种模板,每种引物均进行Mg2+浓度的优化。另外还需注意引物和模板DNA原液中如含EDTA等螯合剂也会影响游离Mg2+浓度。
?优化Mg2+浓度法:首先须知模板DNA,引物和dNTP浓度和设定的PCR循环参数。反应中的PCR缓冲液中不加Mg2+。Mg2+是从10mmol/L MgCl贮存液中逐一加入反应管中。开始以0.5mmol/L递增(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5~5.0mmol/L)，在确定了Mg2+大概浓度以后，再在该浓度上下，以0.2 m mol/L递增和递减几个浓度来精确确定Mg2+的最适浓度。
5．三磷酸脱氧核苷酸
???贮备dNTP液应用NaOH调pH至中性，其浓度用分光光度计测定。贮备液为5~10 mmol/L，分装后–20℃保存。在PCR的重复热循环过程中其热稳定性应为：50循环后约有50%仍为dNTP。
? 反应中每种dNTP（dATP，dGTP，dTTP和dCTP）的终浓度为20―200umol/L,在此范围中，PCR产物量、特异性合成和忠实性间的平衡最佳。所用的四种dNTP终浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。最低的适宜dNTP浓度可根据特定靶序列长度和碱基组成来确定。保持四种dNTP的浓度均在10~15umol/L以上，对保持碱基掺入的忠实性是很重要的。dNTP终浓度大于50 mmol/L时会抑制Taq DNA聚合酶活性。
?dNTP的类似物也可掺入PCR产物。 6．耐热DNA聚合酶
?自从耐热Taq DNA聚合酶引入PCR后，又有多种耐热DNA聚合酶（VENT和Tth等）相继用于PCR。目前仍以Taq DNA聚合酶应用较多。不同来源聚合酶制备条件、测定方法和（或）单位定义有所不同，使用时需加以注意。
?酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。当优化PCR时，最好在每100μ1反应体积中加入0.5~5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果酶浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩增带；过低时，则靶序列产量很低。
?PCR后可通过下述方式之一灭活Taq DNA聚合酶：（1）99~100℃加热10min；(2)加入EDTA-Na至10mmol/L螯合Mg2+；（3）酚一氯仿抽提、乙醇沉淀PCR产物。
7．温度循环参数
①变性温度与时间：PCR的变性一步很重要，此步若不能使靶基因模板和（或）PCR产物完全变性，变会导致PCR失败。典型的变性条件是95℃30s或97℃30s，更高的温度可能更有效，尤其是对富含G+C的靶基因。DNA在其链分离温度（strand separation temperature,Tss）时的变性只需几秒钟，然而反应管内部达到Tss还需一定时间。变性温度太高会影响酶活性。最简单的方法是在加Taq聚合酶前选使模板在先97℃变性lmin，对PCR的成功亦有益处。环状质粒DNA模板最好酶切线性化，因环状DNA复性极快。在扩增短片段（100~300bp）时，可用简便、快速的两步PCR法，同时在5~10个循环后，将变性温度降至87~90℃可改善PCR产量。具体降低程度则根
2+
据具体反应和使用的PCR仪而定。
②复性温度与时间：如果说变性温度对PCR反应的成败是关键，那么复性温度则决定着PCR的特异性。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应低于扩增引物在PCR条件下真实Tm值的5℃。根据下式计算最适复性温度（Tm）有助于PCR的成功。
另一种更简便的方法是通过引物的有效长度(Ln)来估算。在此，还需引入另一概念，即有效启动温度（effective priming temperature Tp）。Tp是最佳引物介导扩增发生时的最高温度。Tp在一定范围（20~35个核苷酸）内与Ln呈直线相关。Lp=22+1.45(Ln):其中Ln=2（G+C）+（A+T）最适复性温度为Tp±2~5℃。Tp值较引物模板的Tss值高5~10℃，这是因引物复性后，DNA聚合酶很快发生聚合反应，在引物3’端加上数个碱基使引物–模板更稳定，易于在较高温度下发生延伸。研究表明，引物的复性是受动力因素控制的，而不是受热力学参数控制的。它取决于引物解离与延伸效率间的平衡。Tp仅是PCR的最适复性温度，也是PCR最佳特异性温度，在等位基因特异PCR（AS–PCR）时决定Tp很重要。Tp值基本上不受Mg2+浓度影响，当Mg2+由1.5mmol/L升至10 mmol/L时，Tp才升高3℃。确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。复性时间也不能太短（≥30s），如用手控温度反应，复性状态的时间不能太长，耽搁过长会增加非特异复性。
③延伸温度与时间
引物延伸温度一般为72℃（较复性温度高10℃左右）。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。72℃时，核苷酸的掺入率为每秒35~100个核苷酸,这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间决定于靶序列的长度与浓度。3~4 kb的靶序列需3~4 min延伸，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现。PCR中前几个循环延伸时间应足够长以使靶序列延伸完全，对很低浓度底物的扩增延伸时间要长些。
④循环数
循环数决定着扩增程度。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。过多的循环会增加非特异扩增产物的数量和复杂性（见平台效应）。当然，循环数太少，PCR产量就会极低。在初始靶序列为3X105，1.5X104，1X103和50拷贝分子时，其循环数可分别为25~30，30~35，35~40和40~45个循环。
除循环数外，扩增效率也决定扩增程度的重要因素。实验表明，以染色体DNA为模板时，第25~30个循环过程中，扩增DNA明显增加。扩增程度（Y）、起始DNA量
n
（A）、扩增效率（R）和循环数（n）间的关系为：Y=A（I+R）效率为100%时，25个循环后，Y=225·A=33 554 432A，而效率R=90%，n=25时，Y=1.925=9 307 649A，扩增产物减少了72%，由此可见扩增效率对扩增程度的影响。
⑤其它因素
高温起动（hot start）：由于Taq DNA聚合酶低温下仍具有活性。因此在一般PCR反应的开始加热变性DNA后再加酶的过程中，引物可与模板发生非特异复性，这些非特异复性在达到72℃前就由Taq 聚合酶在其3'端聚合上几个碱基并稳定了这种非特异复性引物。因此，可出现非特异延伸和扩增。采用高温起动法便可克服这一缺点，即使Taq聚合酶仅在反应达到较高温度（>70℃）时才发挥作用。这可通过在
PCR条件优化
