实验二十四 外周血单个核细胞的分离
(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)
免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。 【实验原理】
血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。 【主要试剂和器材】
1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液 密度为1.077±0.001。 2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液 用Hanks液配制。
,
4.Hanks液。
,
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 6.水平离心机、显微镜。 【操作方法】
1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hanks液混匀。
,
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。 3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。 6.加入4倍量以上的Hanks液，充分混匀，1000r／min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hanks液洗2次。
,
,
7.用含10%～20%灭活小牛血清的Hanks液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。 【结果判断】
,
【注意事项】
1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。
2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。
3.分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。离心速度在2000～2500r/min，离心时间为l5～20min，离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间，若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或离心时间。 4.分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。
5.将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。 6.充分冼涤分离后的单核细胞，可除去大部分混杂的血小板。 【应用与评价】
本方法操作简便、稳定。细胞回收率达80%～90%，单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞活力可达95%以上。但其中仍可混杂少量(约10%)其它细胞。
该方法是目前最理想、最常用分离淋巴细胞的手段，其制备的细胞(主要是淋巴细胞)悬液已能满足许多细胞免疫试验要求，也可用于进一步制备T细胞、B细胞及单核细胞。故在细胞免疫试验中有广泛应用，是细胞免疫检测中最基本的技术之一。 【思考题】
1.为何常用密度为1.077土0.001的分层液分离人单个核细胞？
2.利用密度梯度离心法分离人单个细胞，为何要将血液样品进行适当稀释，并要叠加于分层液上？
外周血单个核细胞的分离—密度梯度离心法
一、原理
根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定比重的液体界面，将外周血中各种不同比重的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。已知人类淋巴细胞和单核细胞的比重大约在1.075~1.090之间，而红细胞与粒细胞的比重均大于1.090。因此，若用比重为1.077±0.001的分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集外周血单个核细胞。
二、器材与试剂
器材：
（1）水平式离心机（2）显微镜（3）血球计数板、血盖片（4）载玻片、盖玻片（5）定量移液器、洗耳球（6）刻度离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8）小滤纸、擦镜纸
试剂：
（1）抗凝全血（临时抽取）、40倍稀释的全血（计数用）（2）淋巴细胞分离液（市售，比重：1.077±0.001）（3）Hanks液（4）白细胞稀释液（5）0.5%锥兰生理盐水溶液
三、操作步骤
在已含1ml抗凝全血的试管内加入1ml Hanks液，混匀，然后用滴管将此稀释全血沿盛有1ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。
将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）20分钟。
用计数板在显微镜下计数40倍稀释的全血，计算出其中的白细胞总数（/ml）及单个核细胞总数（/ml）。
离心后的外周血各成份在试管中的分布位置如下图：
外周血单个核细胞的分离
