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第六章 分子生物学技术
是以核酸、蛋白质等大分子为研究材料，研究其结构与功能，以空前的广度和深度揭示生命现象以及疾病的本质。在临床医学检验中，特别对遗传病和癌基因的检测已成为不可缺少的手段。
第一节 核酸的分离纯化技术
一、DNA的分离与纯化
根据DNA的结构及在细胞中分布的不同，分离提取的方法不同。 （一）大分子量DNA的分离与纯化
制备DNA的样品包括：生物组织、培养细胞、血样。在基因诊断中一般采用外周血白细胞。
制备DNA时，既需要去除蛋白质、脂类和糖类物质，又需要保证DNA的完整性。目前应用较广的方法有氯仿法；去污剂法；酚抽提法。
基本过程包括：
1. 细胞的破碎；（SDS，溶菌酶）
2. 去除蛋白质；（氯仿，苯酚和蛋白酶K） 3. 防止DNA降解；（核酸酶抑制剂，EDTA） 4. 沉淀DNA；（乙醇；异丙醇） 5. 消化RNA；（RNA酶）
6. 纯度测定；可采用紫外分光光度计测定提取物230nm，260nm，280nm的吸光度。A260 /A280≥1.8，A260 /A230≥2.0，表示提取物DNA的纯度好，A260 /A280比值太小，残留蛋白质太多，A260 /A230比值小，残留酚类有机杂质。
（二）质粒DNA的提取与纯化
质粒是游离于细菌染色体之外，具有自行复制子的双链环状小分子DNA。在基因工程中常作为目的基因的载体。
质粒的提取方法很多，如碱裂解法，煮沸法，SDS法等，其碱裂解法是质粒的大量提取的常用方法。
基本原理：在pH12.0～12.6环境中，线状染色体DNA变性，而环状质粒DNA保持自然状态，调节pH至中性，增加盐浓度，使染色体DNA交联，形成不溶性网状结构，在SDS作用下，染色体DNA、蛋白质沉淀，离心，上清液中保留质粒DNA，抽提（酚，氯仿），乙醇沉淀。
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二、RNA的分离纯化
RNA包括：rRNA、tRNA、mRNA。其中mRNA占总RNA1%～5%，含量少，但种类繁多，是分子生物学的主要研究对象之一。
（一）总RNA的提取
主要方法有异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，快速提取法等。
其中盐酸胍-有机溶剂法提取的RNA质量较好。
盐酸胍破碎组织细胞，并抑制RNA酶活性，氯仿去除蛋白质，乙醚沉淀RNA。
（二）mRNA的分离与纯化
利用真核细胞中mRNA 5′末端含有多聚腺苷酸序列，采用Oligo（dT）纤维素柱或Poly U琼脂糖柱的亲和层析。
第二节 DNA分析技术
DNA分析技术主要包括核酸纯化，基因分子克隆以及杂交分析。在医学研究领域多用于临床遗传疾病的基因诊断。
一、基因的分子克隆
基因是DNA分子中的一个片段，这一片段含有合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列。（不仅是结构基因核苷酸序列，还有调控基因序列，内含子，5′，3′端非翻译序列）。
基因的分子克隆：从众多不同基因群体中分离出某一感兴趣的基因分子，通过无性繁殖（扩增），产生很多相同基因分子的集合。
（一）目的基因的制备
从染色体DNA中分离，通过mRNA合成cDNA和化学合成等方法制备。 1. 基因组DNA 将染色体DNA用限制性核酸内切酶切割成基因水平的许多片段，其中含有我们感兴趣的基因片段（目的基因），并与合适的载体进行体外重组，得到一系列重组DNA。这种由载体携带的所有基因组DNA的集合称为基因组文库（genomic DNA librarg）。基因组DNA文库就象图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息。
限制性核酸内切酶（简称为限制酶），能识别DNA的特异序列，并在识别位点或周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制酶存在于细菌体内，目前发现的有1800多种，可分为三类，在重组DNA技术中常用的是Ⅱ类酶。它们识别的核苷酸序列都呈二重对称结构（回文
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结构），切割可产生3种不同末端的DNA产物。
5′…AGCT…3′ Alu Ⅰ 5′…AG3′ 5′CT…3′
平末端 3′…TCGA…5′ 3′…TC5′ 3′GA…5′
5′…GAATTC…3′ EcoR Ⅰ 5′…C3′ 5′AATTC…3′
5′粘末端 3′…CTTAAG…5′ 3′…CTTAA5′ 3′G…5′
5′…GGTACC … 3′ Kpa Ⅰ 5 ′… GGTAC3 ′ 5 ′ C … 3 ′ 3′粘末端 3′…CCATGG…5′ 3′…C5′ 3′CATGG…5′
2. cDNA 以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA（complementary DNA，cDNA），，再复制成双链cDNA片段，与载体进行体外重组，建立cDNA文库，与基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库，包含了细胞全部mRNA信息。
3. 化学合成 如果已知某种基因的核苷酸序列或根据某种基因产物的氨基酸序列，推导出该多肽链编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学原理合成目的基因。
（二）基因扩增 主要方法有两种 1. 通过宿主细胞增殖而扩增
目的基因?载体?体外???重组DNA?转化、转染????引入宿主细胞?繁殖???筛选能表达重组DNA的细胞?????成为克隆繁殖扩增
（1）载体 外源目的基因离开染色体是不能复制的，如果将目的基因连接到复制子上，目的基因则可作为复制子的一部分在受体细胞中复制，这种复制子就是基因载体。目前已发展的基因载体有质粒、噬菌体、病毒DNA、人工染色体载体等。
质粒（plasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。它具有独立复制能力，并可在细胞分裂中与染色体一道分配到子细胞中，作为基因载体的质粒一般应具备以下特性：
① 具有能自主复制的复制子；
② 具有可供筛选的选择标记；营养缺陷型标记，抗菌素标记。 ③ 拥有多种限制酶的单一切点；以便外源基因的插入。 ④ 分子量小，且对外源基因有一定的容量； ⑤ 松弛型复制，多拷贝。
70年代初用的是天然质粒，如今采用的质粒均由天然质粒经人工改建而成。如pBR322，PUC18，PUC19，PGEM系列。
λ噬菌体：为线状双链DNA病毒，寄主是大肠杆菌，与质粒相比，具有以下优点：
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① 对外源基因容量比较大，可插入几kb到20kb的片段；
② 重组DNA可在体外被包裹成噬菌体颗粒，具有更高的感染宿主细胞的能力。
③ 对寄主的选择面较质粒窄，因此，在基因工程操作的安全性上较质粒有保证。
置换载体（取代载体） 一对限制酶切点 λ噬菌体载体
插入载体 单一酶切点
（2）体外制备DNA重组体：目的基因与载体在体外连接方式有多种。如定向克隆、粘性末端连接、平端连接、人工接头连接等。
定向克隆：利用两种不同的限制酶切割目的基因和载体，使载体的两端分别与目的基因的相应末端互补，当摸的基因插入载体时，只有一个方向可供选择。
（3）重组DNA导入宿主细胞 宿主细胞有原核细胞和真核细胞两类。
原核细胞 大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌等。
宿主细胞 大肠杆菌K-12衍生的安全宿主菌是常用的宿主细胞。
真核细胞 酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞
导入的方式有转化和转染，以质粒为载体构建的重组DNA导入宿主细胞的过程称为转化。以噬菌体、病毒为载体构建的重组DNA导入宿主细胞的过程成为转染。
方法有CaCl2法、电穿孔转化法、体外包装转染法等。
2. PCR体外基因扩增 DNA合成体系（模板DNA，与模板5′端互补的引物，Dntp、TaqDNA聚合酶），经反复变性、退火、以及扩增循环，自动地往复多次地进行感兴趣DNA片段的酶促合成，使反应产物按指数倍增。
模板DNA 1min 95℃变性 引物 55℃退火 1min 72℃延伸 1min PCR体外基因扩增示意图
循环 二、基因探针标记
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带有标记物的一段已知序列的DNA和RNA称为基因探针。广泛用于基因克隆筛选、酶切图谱制作，基因点突变等DNA序列分析。
（一）基因探针种类 根据来源与性质可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、人工合成的寡核苷酸探针。
（二）基因探针的标记方法 1. 标记物 应具备以下特性 ① 高度灵敏性；
② 标记物与探针分子结合，绝对不影响其碱基配对的特异性； ③ 不影响探针分子的主要理化特性；如杂交特异性、杂交稳定性。 ④ 应用酶促方法进行标记时，对酶活性（Km值）无较大影响； ⑤ 有较高的化学稳定性，保存时间长。
放射性核素类 常用的有
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P、3H、35S，灵敏度极高，不影响碱基
标记物 配对的特异性、稳定性、杂交性质；放射污染，保存时间短。
非放射性核素类 常用的有地高辛、生物素。是半抗原，利用它们
的抗体通过免疫反应检测，无放射污染，稳定性好，保存时间长，但灵敏度、特异性不如放射性核素。
2. DNA探针标记法 常用的标记法有末端标记法、切口平移法、随机引物法等。
末端标记法的特点是DNA片段并非均匀标记，只将其中的一端（5′端或3′端）进行部分标记，标记活性不高。主要的工具酶是Klenow DNA聚合酶。Klenow DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的片段，也称为Klenow片段，具有DNA聚合酶活性及3′→5′外切酶活性，但无5′→3′外切酶活性。
5′ 3′ 3′ 5′
限制性内切酶
5′ 3′
3′ 5′ 5′末端突出的DNA
Klenow DNA聚合酶 4种dNTP，其中一种标记
5′ 3′ 3′ 5′
变性
末端标记的单链DNA探针
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完整DNA双链
(整理)07分子生物学技术.
