分子标记技术在莲研究中的应用与进展 - 图文

Botanical Research 植物学研究, 2020, 9(4), 284-293

Published Online July 2020 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/br https://doi.org/10.12677/br.2020.94035

Application Advance of Molecular Markers in Lotus

Heyun Song1,2, Yunmeng Wang1,2, Xianbao Deng1,3, Heng Sun1, Mei Yang1,3*

1

Key Laboratory of Plant Germplasm Innovation and Characteristic Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Wuhan Hubei 2

University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 3

Collaborative Center, Core Botanical Garden of Chinese Academy of Sciences (Wuhan), Wuhan Hubei

Received: Jun. 1, 2020; accepted: Jun. 24, 2020; published: Jul. 1, 2020

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Abstract

Lotus is an important aquatic crop in China, which has high ornamental, edible and medicinal val-ue. As a new type of genetic marker, molecular markers have been successfully applied to lotus classification, genetic diversity analysis, germplasm identification, construction of genetic map, and the mapping of important traits. This article systematically reviewed the application of the molecular markers in lotus research, and further discussed the potential prospects.

Keywords

Lotus, Molecular Marker, Germplasm of Identification, Genetic Diversity, Map of Construction

分子标记技术在莲研究中的应用与进展

宋贺云1,2，王云梦1,2，邓显豹1,3，孙 恒1，杨 美1,3*

12

中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室，湖北 武汉 中国科学院大学，北京 3

协同中心、中国科学院核心植物园(武汉)，湖北 武汉

收稿日期：2020年6月1日；录用日期：2020年6月24日；发布日期：2020年7月1日

摘 要

莲是我国重要的水生经济作物，集观赏、食用、药用等价值于一身。分子标记作为一种新型遗传标记，

*通讯作者。

文章引用: 宋贺云, 王云梦, 邓显豹, 孙恒, 杨美. 分子标记技术在莲研究中的应用与进展[J]. 植物学研究, 2020, 9(4): 284-293. DOI: 10.12677/br.2020.94035

宋贺云 等

目前已成功应用到莲分类、遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建和重要性状定位等领域。本文系统介绍了现阶段常用的几种分子标记技术在莲研究中的应用现状，并对其应用前景进行了展望。

关键词

莲，分子标记，种质鉴定，遗传多样性，图谱构建

Copyright ? 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Open Access 1. 引言

莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)属于山龙眼目莲科(Nymphaeaceae)莲属(Nelumbo)，是一种多年生水生植物。目前，莲属在世界上仅存在两个种：亚洲莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)和美洲黄莲(Nelumbo lutea Willd.)。莲在我国具有悠久的栽培历史，在青铜器时代就已作为粮食被食用，中国古代的宫殿花园莲也被视为珍贵的观赏植物，许多文人墨客亦留下了赞美莲花高洁品质的诗词歌赋[1] [2]。莲具有多种价值，其果实–莲子和地下茎–莲藕既可食用又可入药，莲花的花色艳丽，姿态优雅，深受大众喜爱，与花中之王牡丹、花中之魁梅花等并列为我国的十大名花。莲作为我国重要的水生经济作物，对其研究主要集中在品种分类、生长发育、生理特征、遗传育种等方面。进入二十一世纪以来，随着分子生物学及相关学科的迅猛发展，对莲的研究开始深入到分子水平，包括莲品种鉴定、亲缘关系的分析，莲系统进化和遗传多样性的研究，莲基因组测序及遗传图谱的构建，莲重要基因的挖掘及功能分析等方面，为进一步解析莲的生长发育分子机理、种质资源保存利用及新品种的培育等奠定了重要的理论基础。

分子标记是指反映个体间DNA分子水平上遗传多态性的遗传标记，该技术作为一种全新的遗传标记方法，具有准确性高、重现性好、多态性高、稳定性好、检测手段简便快速等突出的优点。自1974年第一代分子标记限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)出现以来，随着基因组测序技术及相关研究技术的兴起，越来越多的分子标记被开发出来，包括随机扩增多态性(Random Amplified Polymorphism, RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、相关序列扩增多态性(Sequence-Related Amplified Polymorphism, SRAP)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)等不同类型的分子标记。每一种分子标记技术在检测的多态性水平，位点特异性，重复性及技术要求等方面侧重点都不尽相同，不存在一种理想的分子标记技术可以适用于任何一种情况[3] [4]。目前这几种分子标记已应用于莲分类、遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建和重要性状定位等方面的研究中(表1)。

2. 莲的分类研究

莲是世界上最古老的双子叶植物之一，它的地理分布广泛，亚洲莲主要分布在亚洲、大洋洲，而美洲黄莲主要分布在北美洲[5]。在中国，莲的观赏价值自古以来就备受关注，经过长时间的人工栽培和选育，已产生了丰富的莲品种资源。对莲品种进行科学、实用的分类有助于莲种质资源的保存与管理，为莲资源的进一步开发和利用奠定理论基础。长期以来，研究者不断探索品种分类的理论和方法，取得了重要的成果。目前莲品种是采用“3种系、6群、14类、38型”的分类系统，是按照品种演化为主，形态、应用差异为辅的原理进行的分类[6]。但由于品种间的频繁杂交，一些形态性状难以准确界定，此分

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类系统也受到了很大的挑战。近年来，分子标记由于不受组织类别、发育阶段和环境条件的影响，已广泛应用于莲分类研究中，在澄清品种关系的同时，对形态特征在品种分类中的作用也做出了分析，形成了既反映品种遗传关系又实用的品种分类系统。

Table 1. Comparison of different molecular marking techniques and the application in lotus 表1. 不同分子标记技术的比较及在莲中的应用

标记

重复性 稳定性 多态性

DNA 质量 低

检测范围 遗传特点

在莲中应用现状 遗传多样性分析 聚类分析

DNA指纹图谱绘制 遗传多样性分析 聚类分析 QTL定位分析

优点 特异性强， 操作简便 多态性强， 结果稳定， 重复度高

缺点 稳定性及重复性

较差

RAPD 中等 较低 较高 全基因组 显性

AFLP 高 高 较高 高 全基因组 显性

成本较高

SRAP 高 高 高 高 全基因组 共显性

遗传多样性分析

依赖PCR反扩增

聚类分析 简便、不需预知序

效率，分子标记随

遗传连锁图谱构建 列信息、多态性强

机分布

QTL定位分析 遗传多样性分析 聚类分析

DNA指纹图谱绘制 遗传连锁图谱构建 QTL定位分析 遗传连锁图谱构建 QTL定位分析

依赖PCR扩增效

多态性丰富，

率，现有标记数量

覆盖率高，

有限，

重复性好

标记开发难度大 数量多， 分布广泛， 自动化检测

SSR 高 高 高 中等 重复序列区 共显性

SNP 高 高 高 高 全基因组 共显性

标记开发成本高

经典植物分类学将莲属分为两个种：中国莲和美洲黄莲。这两个种在植物形态上很接近，仅植株大小、叶片形状和花色略有差异。中国莲多数植株高大，叶椭圆形，花为粉红或红色。美洲黄莲植株矮小，叶近圆形，花黄色单瓣[7]。两者虽在地理上被太平洋所间隔，但不存在生殖隔离，相互杂交可育。因此中国莲和美洲黄莲是否应该划分为两个独立的种成为学者争论的问题。Les等[8] 1991年的研究结果表明莲属这两个种的叶绿体基因rbcL序列同源性高达99.9%。一年后，黄秀强[9]等人通过核型、染色体组分析及银染的研究结果表明莲属的两个种染色体组高度同源，相互杂交可育，不存在生殖隔离。基于以上证据，他首次提出应将美洲黄莲归为中国莲的一个亚种。王其超等[10]人通过多次重复的杂交实验再次证明了中国莲与美洲黄莲品种杂交可受精结实，完全不存在生殖隔离，进一步支持了该观点。21世纪以来，分子标记技术被用来分析中国莲和美洲黄莲的亲缘关系。郭宏波等[11] [12] [13]采用RAPD分子标记发现美洲黄莲与中国莲的花莲类群遗传背景较为相似，在DNA水平上未表现出明显的特异性，因此支持美洲黄莲归为中国莲的亚种。然而，近几年利用ISSR、AFLP等分子标记对两者遗传关系的研究结果均表明两者存在较远的遗传距离，在DNA水平上差异显著，即中国莲和美洲黄莲应独立为两个类群[14] [15] [16] [17]。利用SSR分子标记分析中国东北、泰国与美洲的野生莲资源的亲缘关系，同样支持中国莲、泰国莲独立于美洲黄莲[18]。Huang等[19]利用基因组重测序技术对中国莲、泰国莲和美洲黄莲进行全基因测序和分析，发现美洲黄莲完全独立于中国莲、泰国莲。因此，现阶段大多数学者认为美洲黄莲作为一个单独的种更为合理，支持美洲黄莲作为一个独立的种这一观点。

莲在我国拥有悠久的栽培历史。经过长期的人工选择，按照栽培目的及农业用途栽培莲被划分为三大类：花莲、子莲和藕莲[20]。花莲具有很高的观赏价值，经过漫长的人工选择，其品种较为丰富，不仅

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有池塘大型莲花，也有小型的碗莲和缸莲，花型、花色丰富多样[21]。子莲以采摘莲籽为主要的栽培目的，其莲蓬一般较大、结实率高，如湖南湘莲、福建建莲等[22]。藕莲是我国特色的水生蔬菜，以采收肥大的地下根状茎为主要栽培目的，故其地下茎生长旺盛，较粗壮，开花少，植株比较大。采用不同的分子标记技术对栽培莲的类群划分结果与传统园艺学分类结论基本一致。早在2004年，郭宏波等[11] [12] [13]采用RAPD分子标记将莲属资源分为花莲、子莲和藕莲三大类型，三者之间存在较明显的遗传分化。之后对野生莲与千瓣莲资源进行分析发现野生莲与栽培莲资源类似，均可分为三大类群，推测现代栽培莲是由不同遗传背景的野生莲驯化而来，为野生莲资源的进一步开发和利用奠定了理论基础。这是首次从分子水平上将中国栽培莲进行类群的划分，证实了园艺学分类系统的合理性。同时，该研究还对三个类群的遗传关系进行了初步分析，为莲新品种的选育提供了重要的理论基础。瞿桢等[23]利用SRAP标记也得出类似的结论，即栽培莲三大类群有明显的界限。其中花莲和子莲遗传距离较近，藕莲和子莲具有较远的遗传距离。Hu等[16]利用AFLP和SSR两种分子标记对栽培莲的类群进行划分，也表明三大类群之间存在明显的差异。借助分子标记技术对栽培莲的分类研究是对传统园艺学分类方法的一个有效补充和验证。

在中国莲的生态型划分方面，张行言等在《中国荷花品种图志》一书中将花莲资源分为热带型和温带型两种类型[24]。热带型莲主要生长在热带地区(如泰国、印度和中国热带地区)，其生长常年不停顿，秋季地下茎仍呈鞭状生长，不膨大成变态器官藕。温带型莲具有明显的年生长周期，一般于每年四月份开始萌芽生长，花期多集中在六月至八月，冬季在低温的影响下，生长停顿，地上部位枯萎凋谢，地下茎的前端数节膨大成贮藏器官藕而进入休眠期，第二年春季天气回暖，地下茎开始发芽，由此进入新一轮的生长周期。2007年，柯卫东等[25]对水生蔬菜资源考察收集的过程中发现东北地区的野生莲在武汉生长矮小，地下茎膨大明显提早，不同于长江中下游地区的野莲资源，因此他们建议应将莲按照纬度分布划分为三种生态型：温带型、亚热带型和热带型。之后，有学者从叶绿体序列变异的角度证实东北野莲单倍型和我国中部南部地区的野莲单倍型存在显著差异，认为两者应该属于不同生态型[26]。Yang等[18]利用SSR分子标记对泰国和中国东北野生莲的遗传多样性的研究表明，两者在在遗传上存在明显的差异，将中国东北野莲归为温带型，而泰国野莲归为热带型。该研究为两种生态型的划分提供了有利的分子依据，说明按照生态型的分类方法是合理的。基于以上证据，将莲划分为温带型、亚热带型和热带型三种生态型更具有说服力。

3. 种质资源的遗传多样性研究

植物的遗传多样性大小是物种长期进化的产物，遗传变异的丰富程度反映了该物种对环境变化的适应能力，同时也是遗传育种研究的基础和核心。DNA分子标记的使用可以不受环境、材料来源的限制，直接从分子水平上揭示不同莲品种之间的多态性。由于现代农业的发展，莲的栖息地受到了严重破坏，因此评价莲遗传多样性水平对保护莲种质资源尤为重要。早期对莲的研究中，RAPD分子标记的使用最为广泛。郭宏波等[11]在2004年利用RAPD技术对所选取的32份莲品种进行遗传多样性的初步分析，结果显示在扩增形成的207条谱带中存在多态带193条，占百分比为93.23%，这一结果表明该属植物在我国具有丰富的遗传多样性，并且存在明显的遗传分化。之后，他们又对野生莲和千瓣莲品种资源进行了多态性分析，多态性条带所占的比例分别为56.03%和57.45%，初步表明野生莲和千瓣莲在我国具有丰富的遗传多样性[12] [13]。郑宝东等[27]在2006年利用RAPD标记技术对来自全国不同地区的22个莲子栽培品种及野生品种进行遗传多样性分析，结果显示在扩增出的109条DNA指纹谱带中含多态性片段83条，占总数的76.1%。初步证明这些品种间存在丰富的遗传多样性，但品种间的遗传距离与所采集地区的差异之间并不存在直接的关联。之后，An等[28]利用RAPD技术对来自我国18个不同省份的94份

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莲材料进行种群遗传结构的分析，结果显示多态位点达67.15%，证明莲具有丰富的遗传多样性。但由于RAPD技术本身的局限性，如特异性不高、重复性差或不能鉴别纯合子和杂合子等，且RAPD技术极易受到各种因素的影响，如基因组DNA的复杂性，DNA模板浓度和质量，PCR的循环次数，技术设备等，限制了其使用和推广。

AFLP、ISSR、SSR、SRAP等分子标记也被广泛的应用到莲遗传多样性的评价中。薛建华等[29]利用RAPD和ISSR两种分子标记对采自黑龙江地区的47份野生莲、俄罗斯兴安斯克保护区的两份野生莲及中国其他省的27份栽培莲进行遗传多样性分析，结果显示RAPD多态性位点中，野生莲的多态位点比例(50.44%)和有效等位基因数(1.1992)均低于栽培莲的(53.98%, 1.2875)，用ISSR标记显示为同样的结果，说明野生莲群体的遗传多样性低于栽培莲，该研究对黑龙江地区野生莲的遗传多样性进行了客观分析，初步探究了其遗传变异的地理分布规律，为黑龙江地区野生莲资源的遗传多样性保护提供了重要的科学依据。为了对我国现存的野莲资源进行有针对性的保护，Han等[30]对我国华中地区不同湖泊的野生莲进行了遗传多样性的分析，采用ISSR分子标记分析了6个种群间及种群内部的遗传变异，发现物种水平上野莲居群具有较高的多态性，多态带占比为90%，而群体间遗传分化较大，多态带占比仅35.8%，因此提出就地保护和远征收集具有最高遗传变异的代表性种群等措施来进行野莲资源的保护。Pan等[31]利用开发出的23个EST-SSR标记对39个中国莲栽培品种、10个野生莲品种及1个美国黄莲进行遗传多样性分析，结果表明栽培莲品种和野生莲品种及不同子莲和藕莲品种间均存在不同程度的遗传分化。李长春等[32]利用8个ISSR分子标记分析了39份莲品种的遗传多样性，在扩增出的89条带中含多态带55条，多态性比率为61.8%，并且通过遗传相似系数和聚类分析可以将这些莲品种完全区分开考。Liu等[33]在2012年利用开发的11对SSR引物对来自世界各地的71份莲品种进行了聚类分析，表明中国莲具有丰富的遗传多样性，并对它们的亲缘关系进行了初步分析。综上所述，莲具有丰富的遗传多样性。分子标记技术作为研究莲遗传多样性的一个有效手段，对我国重要莲种质资源的保护具有重要的意义，以便更好的进行莲资源的保存和利用。

4. DNA指纹图谱构建和品种鉴定

一直以来，对莲品种的分类主要根据形态特征，如花型、花色、花态、花径、花期、株高、雄蕊、雌蕊、莲蓬的形状、主藕的节数和节间形状等[34]。然而大多数形态性状受不同产区环境的影响较大，因此很容易出现同物异名，或者同名异物等问题。

DNA指纹图谱是指DNA样品用特定分子标记技术处理显示出具有特定DNA片段的总称[35]。指纹图谱个体特异性高、多态性丰富且不易受环境影响较为稳定，类似人类的指纹，因此称为“指纹图谱”。DNA指纹图谱是新品种评审的重要依据之一，该技术可为种质资源的准确鉴定提供重要的理论指导。

莲是我国特色的水生蔬菜，其分布广泛且栽培面积较大，随着新品种的不断增加，加强新品种的准确识别与鉴定对于合理优化种植区域进而提高生产效率意义重大。莲传统的分类方法主要是以形态学特征为依据，通常大多数形态性状受不同产区环境的影响较大，因此鉴定起来存在一定的困难。DNA指纹分析技术能够解决这一难题，为品种间的遗传差异研究提供便利。韩延闯等[36]采用RAPD技术成功地绘制了14个莲藕品种的DNA指纹图谱，并通过实验验证了该图谱中的每个品种均有其特异的DNA指纹。该发明专利为莲藕新品种的登记和保护提供了分子依据。全志武等[37]利用6对基因组SSR标记得到10个藕莲品种的SSR指纹图谱。10个藕莲品种的SSR指纹图谱互不相同，可以作为各品种的特定图谱，作为品种鉴别的重要依据。碗莲的DNA指纹图谱也被成功绘制，还利用RAPD分子标记对这些碗莲品种进行了遗传多样性的分析[38]。薛建华等[39]将双亲遗传核微卫星(nSSR)和母系遗传的叶绿体微卫星(cpSSR)两种标记相结合，利用72个莲品种材料进行分子标记，成功筛选出扩增效果好、多态性高的

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