阳离子双亲性多肽-脂质纳米粒子的构建及细胞毒性和体外稳定性

阳离子双亲性多肽-脂质纳米粒子的构建及细胞毒性和体外

稳定性

王 乔1,2, 费 浩2

【摘 要】摘要: 选用阳离子双亲性R多肽(RLARLLRRLARWLR)进行脂质纳米粒子的构建.通过脂质乳浊液清除实验、色氨酸荧光光谱蓝移实验,对R多肽与脂质的重组过程和作用方式进行表征.通过透射电子显微镜观察、动态光散射、zeta电位检测,表征了所构建的阳离子双亲性多肽-脂质纳米粒子(R peptide-lipid nanoparticle,R-LNP)的粒径和表面性质.通过MTT实验检测了R-LNP的细胞毒性;通过超高效液相色谱(ultra high performance liquid chromatography,UPLC)方法比较了R多肽和R-LNP抗酶解(糜蛋白酶、胰蛋白酶)的稳定性.结果表明,R多肽能促进脂质的重组,其疏水性部分嵌入脂质纳米粒子的疏水核心,形成粒径为(14.7±0.1)nm,zeta电位为17.8 mV的脂质纳米粒子.R-LNP对A549和MCF-7细胞的半抑制浓度为(5.93±0.75)和(4.36±0.40)μmol/L,保留R多肽细胞毒性作用,同时R-LNP有效提高了R多肽的稳定性,有助于多肽的体内应用.

【期刊名称】上海大学学报（自然科学版） 【年(卷),期】2024(024)001 【总页数】9

【关键词】关键词:阳离子双亲性多肽;脂质纳米粒子;构建;功能

高密度脂蛋白是体内天然存在的脂质纳米粒子,主要由脂质和载脂蛋白(Apo A-I等)组成,生物相容性好,体内循环时间长,是一种极具前景的药物载体[1-2].目前已有大量研究证明,在体外利用Apo A-I蛋白或其类似物可以将磷脂组装成类似高

密度脂蛋白的纳米粒子,成功输送各种化合物或者多肽分子[3].Apo A-I蛋白由243个氨基酸组成,形成高度同源的10个双亲性螺旋结构[4].Apo A-I蛋白的模拟肽(如18A,4F多肽等)与Apo A-I蛋白在氨基酸组成上没有同源性,在二级结构上模拟Apo A-I蛋白,具有双亲性的螺旋结构,并且阴离子性氨基酸和阳离子性氨基酸按照A类螺旋构型分布[5-7].Apo A-I蛋白的模拟肽呈现电中性.此类双亲性螺旋多肽的疏水面与脂质的疏水头部相互作用,组成疏水性的内腔,亲水面与脂质的亲水性头部暴露于水溶液[8].在前期工作中,本课题组利用Apo A-I蛋白第10个螺旋上的多肽,成功构建了具有整合素靶向功能的脂质纳米粒子,实现了纳米粒子的靶向运输[9],并且为了进一步探究功能多肽是否可以通过脂质纳米粒子得到优化,选取了阳离子双亲性多肽进行验证.

阳离子双亲性多肽属于阳离子性抗菌肽,是由亲水和疏水氨基酸构成的α螺旋结构[10].此类多肽不但具有抗菌特性,而且对肿瘤细胞具有杀伤功能[11].大部分肿瘤细胞膜具有负电位,与阳离子双亲性多肽通过静电引力相互作用,将多肽吸附到细胞表面引起细胞膜的破坏或者进入细胞内部引起线粒体、细胞骨架等结构的破坏,从而引起肿瘤细胞的死亡[12-13].但是阳离子多肽稳定性差,易被多种酶消化降解,而借助适当的载体,可以提高多肽的稳定性.本工作利用阳离子双亲性多肽的螺旋结构,使多肽与脂质相互作用,形成类似高密度脂蛋白的纳米粒子,提升多肽的抗酶解能力.目前,对于阳离子双亲性多肽形成类高密度脂蛋白纳米粒子的研究还未见报道.

1 材料和方法

1.1 实验材料

二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoyl phosphatidyl choline,DMPC)购自

Avanti公司;胆固醇油酸(cholesterol oleate,CO)、噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司;DMEM(High)培养基,RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Hyclone公司;R多肽(纯度＞95%,相对分子质量为1 849.31)由上海波肽公司合成;二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)、三氯甲烷等试剂购自国药集团;糜蛋白酶和胰蛋白酶购自阿拉丁公司;96孔板、细胞培养皿购自Corning公司. 1.2 实验方法 1.2.1 多肽定量

将上海波肽公司合成的多肽通过nanodrop测定肽键在205 nm的吸收值,进行准确定量后使用.

1.2.2 脂质纳米粒子的制备

3μmol DMPC,0.1μmol CO溶于氯仿溶液,置于圆底离心管内,用稳定的氮气流室温挥发氯仿1 h,混合物在离心管底部形成薄膜;加入1 mL磷酸缓冲液(phosphate buあer saline,PBS)(pH=7.4),室温涡旋震荡10 min,形成乳白色的乳浊液;充入氮气,密封,在48?C水浴、功率200 W条件下,超声1 h,形成DMPC/CO乳浊液;滴加等体积R多肽溶液,多肽与DMPC的摩尔比为1∶10,4?C放置过夜,得到脂质纳米粒子.脂质纳米粒子通过100 kD的超滤管进行纯化,去除游离的多肽、DMPC和CO分子. 1.2.3 脂质乳浊液清除实验

按照1.2.2节方法,在滴加多肽之前,获得DMPC/CO乳浊液.取96孔板,每孔加入100μL乳浊液和100μL R多肽(多肽与脂质的摩尔比为1∶10),室温孵育,测定不同时间点溶液的吸收值(490 nm),表征多肽与脂质相互作用的动力学过程. 1.2.4 色氨酸荧光光谱蓝移实验