DNA提取
缓冲液的制备：
Extraction buffer
6.8 mL 1 M NaH2PO4 (monobasic单碱的) 93.2 mL 1 M Na2HPO4 (dibasic 二碱价的)
Combine phosphate sol., pH to 8.0 with NaOH, continue with remaining ingredients 将磷酸盐溶胶(pH值为8.0)与氢氧化钠混合，继续加入其余溶液 200 mL 0.5 M EDTA, pH 8.0 100 mL 1 M Tris-HCl 300 mL 5 M NaCl
100 mL 10% CTAB [for filter samples, leave CTAB out 对于过滤样本，不要使用CTAB]
Bring to 1 L with DI water, if CTAB is left out; bring to 900 mL with DI water 如果CTAB省略;取900毫升的去离子水
Final concentrations（终浓度）: 0.1 M NaH2PO4, 0.1 M Na2HPO4, 0.1 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 1% CTAB) Other Chemicals Needed: Proteinase K
10 mg mL-1 (store at -20C) 20 % SDS (pre-made)
70 % Ethanol (cold, store at -20C) 2-Isopropanol
0.5 M EDTA, pH 8.0 1 M Tris-HCl 5 M NaCl
Chloroform三氯甲烷:isoamyl alcohol异戊醇 (24:1)
Combine the chloroform and isoamyl alcohol and store in a dark or foil covered bottle and keep it in the flammables cabinet below the fume hood. 混合氯仿和异戊醇，储存在一个黑色的或铝箔盖的瓶子，并保持在通风柜下面的可燃物
[For filter samples: 10% CTAB (store at room temperature – heat to redissolve) 储存在室温-加热重新溶解] Other Notes:
The Oak Ridge tubes used in this protocol should not be autoclaved. If the tubes are autoclaved, the DNA pellet does not form a tight pellet and can be difficult to see. To clean the tubes, rinse them in DI water after use and then boil for 20 min in DI water. Once cooled, rinse the tubes with 70% EtOH and dry.
本协议中使用的橡树脊管不应进行高压灭菌。如果管是高压灭菌的，DNA颗粒不会形成一个紧密的颗粒，可能很难看到。冲洗后用去离子水冲洗，再用去离子水煮沸20分钟。冷却后，用70% EtOH冲洗试管并干燥。
方案：
(8)对于土壤或沉积物，称5克样品到无菌砂浆中。每次只取出一个样品，以尽量减少DNA在室温下的降解。[对于过滤器，添加复苏的颗粒到研钵]。在研钵中加入2克无菌砂。如果需要，可以添加更多的沙子。向砂浆中加入液态N2，使砂和砂浆冷却。对N2要慷慨。
(9)在砂/样品中加入更多的氮气，氮气蒸发后开始研磨。试着把样品装在一小块灰浆上。研磨直到样品开始融化。如果可能的话，在研磨时保持样品冷冻(如果土壤干燥多沙，这很容易做到)。但是如果样品在冷冻时很难研磨，你可以让它解冻，但是一定要在样品中加入1-2毫升的提取缓冲液。当温度升高时，具有抑制DNA降解的缓冲液。
(10)重复冷冻研磨2次，共3次。 (11)当样品仍处于冰冻状态时，用抹刀刮取砂浆的边缘，以收集砂浆中心的样品(如有必要，增加N2以保持样品的冰冻)。用抹刀将其转移到先前收集的上清液(用于过滤样品)或新的试管(用于土壤和沉淀物)中。
此时，样品可以保持冷冻(-80℃)，直到准备好进行DNA提取
(12)将样品从冰箱中取出并解冻。对于土壤和沉积物样品，添加16.5 mL提取缓冲液(CTAB)，然后进行步骤14。缓冲液的总体积应该是16.5毫升，所以如果你在冷冻研磨过程中添加缓冲液，记住要从这一步添加的缓冲液中减去这个量。 (13)过滤样品，在解冻和加热的样品中加入1.5 mL 10% CTAB(终浓度，1%)，轻轻混合。
(14) Tris缓冲液中加入61 mol / L蛋白酶K (10 mg mL-1)，轻轻混合。对于管道缓冲区，请跳到步骤16。在37°C
(15)孵化30分钟(保持在37°C水浴和转化每5-10分钟) (16)添加1.83毫升20% SDS混合轻轻在65°C
(17)孵化2 h与温柔的反演三羟甲基氨基甲烷缓冲液每15 - 30分钟。在65°C孵化1 h管缓冲与温和的反演每15 - 30分钟。
(18)离心20分钟,3600 x g 25°C(使用台式离心机)。如果样品脏了，将速度提高到6000 x g。
(19)将液体转移到50ml的锥形离心管中，避开表面的白色层。(液慢慢倒入新管,管的表层仍将——如果表层分裂,您可以使用一个吸管)
(20)添加6毫升包含CTAB提取缓冲区(或5.5毫升没有CTAB提取缓冲+ 0.55毫升10% CTAB)剩下的砂颗粒和混合。
(21)添加0.67毫升20% SDS混合轻轻在65°C (22)孵化15分钟
(23)离心10分钟,3600 x g 25°C
(24)收集上层清液,结合以前的上层清液,避免了表层与步骤17
(25)中提取上层的同等体积的异戊:氯仿(1部分异戊,24部分氯仿)5 - 10分钟的连续反演(转子位于通风柜可用于连续混合样品)
(26) 3700 x g离心，20分钟-使用台式离心机(桔黄色或紫色的锥形管可以承受这个速度)。
(27)将上清液收集到一个新的锥形管中。
(28)重复步骤23-25，除非将上清液转移到橡木脊管中(使用半透明的橡木脊管)。(29)加入0.6体积的2-异丙醇(非常重要的是添加0.6体积)(30)-20或-80℃孵育过夜。低温会帮助DNA沉淀。
(31)将试管从冰箱中取出，放入37℃的水浴中加热。在进行之前，确保样品是温暖的并且所有的沉淀物都溶解了。在离心前加热样品将溶解可能在一夜之间形成的任何矿物沉淀。
(32)在25℃下15000 x g (RCF)离心20分钟(确保离心机是在RT -如果太冷，样品中的矿物沉淀将允许形成)。离心后立即将上清液转移到一个新的试管中(保持上清液直到你知道是否存在DNA)。
(33)洗丸1毫升冰冷的70%乙醇,如果没有可见的颗粒,离心机15000 x g, 5分钟
(34)允许颗粒干燥10-15分钟。
(35)溶解的颗粒50-500μL nuclease-free水预热至50°C(从50μL开始,如果颗粒较大,使用一个较大的体积)。此时DNA可以保存在-20℃或-80℃(长期保存)。对于沉积物样品，尽量保持体积小，立即开始凝胶净化。
(36)可选:使用nanodrop和/或使用DNA凝胶(~1 mol L)测量过滤样品的DNA浓度。请记住，此时nanodrop可能不是很准确。DNA中可能的污染物(例如腐殖质)的吸光度值在230-280 nm范围内。根据曲线，260/280比例，凝胶图像，判断是否需要纯化。如果您对DNA的质量或数量有疑问，请与Liyou讨论后再继续。
如果DNA来自微生物活性高的地方，检查一下是否有大量的RNA。如果是这样，在继续之前应该使用RNase协议删除它。大量RNA的存在可能会干扰随后的步骤。
注:提取的DNA应在提取后尽快纯化，随着提取的DNA年龄的增长，DNA会降解，纯化困难。
对于用TRIS缓冲液提取的土壤和沉积物样品，请参阅“土壤和沉积物的凝胶净化”
微量DNA提取
