中华鳖伪雌鳖及全雄中华鳖的培育方法 CN 102763625 A摘要
本发明公开了中华鳖伪雌鳖及全雄中华鳖的培育方法，属于水产动物遗传育种技术领域。中华鳖伪雌鳖的培育方法，包括受精卵的孵化和稚鳖诱导，受精卵的孵化温度为25℃，刚孵化出的稚鳖用17β-雌二醇进行投喂诱导而得到中华鳖伪雌鳖，17β-雌二醇浓度为45mg/kg饲料。全雄中华鳖是由中华鳖伪雌鳖与表型和基因型均为雄性的中华鳖交配后获得。采用本发明的方法，可以得到较大数量的伪雌中华鳖，为培育全雄中华鳖提供足够数量的亲本群。采用本发明的方法，可以获得全雄中华鳖后代，免去了人工进行筛选所花费的时间和劳动力成本。 说明
中华鳖伪雌鳖及全雄中华鳖的培育方法
技术领域
[0001] 本技术属于水产动物遗传育种技术领域，特别涉及中华鳖伪雌鳖（即基因型为雄性表型为雌性）的诱导方法和全雄中华鳖的培育方法，应用于鳖类性别控制和全雄苗种培育。
背景技术
[0002] 中华鳘（Trionyx sinensis)其肉味鲜美、营养丰富、滋补力强,是我国名特水产养殖动物之一。目前中华鳖养殖业迅速发展，形成了规模较大、影响力较强的特种水产养殖产业。不同性别和个体间存在着明显的生长差异，雄性中华鳖生长显著快于雌性，其日增重率为雌性中华鳖的I. 09倍，因此全雄繁育技术是鳖产业需要解决的难题。目前，有关中华鳖性别分化的研究主要集中在环境因素的作用（聂刘旺等，2001 ;Ji et al. ,2003)以及性腺 发育和内分泌的研究（Lofts B. and Tsui H. W.，1997 ;朱道玉，2009)等。中华鳖在不同季节的由脑垂体与性腺共同调节性腺和附睾性腺功能（Tsui et al.，1977)。在中华鳖性腺自受精卵孵化至性成熟阶段中，胚胎发育至第5天形成生殖嵴；第16天原始生殖细胞开始分化，至第24-26天性腺分化结束形成精巢或卵巢（朱道玉，2009)。章龙珍等（1998)通过温室养殖对中华鳖性腺发育的影响研究发现，温室养殖可以使加快中华鳖性腺成熟，雌性性成熟只需21个月，雄性需10个月。在性别分化方面Ji et al. (2003)等的研究显示，中华鳖孵化温度由24°C升高到34°C，雄鳖的比例没有显著差异，表明中华鳖性别决定机制中存在GSD型。孵化温度由22°C升至35°C，雄性中华鳖的孵化比例由27. 27%提高到67. 57%,在一定范围内，温度升高会提高雄性中华鳖孵出的比例（巫旗生等，2011),与聂刘旺的研究结果类似。叶玉珍等（1999)
通过甲基睾丸素对中华鳖外部性征诱导作用的研究发现，夕卜源雄性激素对稚鳖的外部性征及行为有较大的诱导作用。2007年，Kawai et al.通过基因组杂交技术发现中华鳖中存在ZZ/ZW型微小性别染色体。因此，迄今为止，通过温度的环境因素和雌性激素诱导因素来控制中华鳖的性别，国内外尚未见报道。
发明内容
[0003] 本发明是通过研究孵化温度和17 β_雌二醇对中华鳖进行性别控制，得出影响中华鳖高雌性率的孵化温度条件和17 β -雌二醇的投喂诱导浓度，建立诱导中华鳖性逆转的技术方法，用于中华鳖性别控制和全雄中华鳖培育。
[0004] 本发明的技术方案如下：
[0005] 中华鳖伪雌鳖的培育方法，包括受精卵的孵化和稚鳖诱导，受精卵的孵化温度为250C，刚孵化出的稚鳖用17 β -雌二醇进行投喂诱导而得到中华鳖伪雌鳖，17 β -雌二醇投喂浓度为45mg/kg饲料（每公斤饲料中拌45mg的17 β -雌二醇),诱导时间为30天。
[0006] 所述的中华鳖伪雌鳖培育方法，对稚鳖用17 β -雌二醇按照45mg/kg饲料的浓度进行药物诱导30天。
[0007] 全雄中华鳖的培育方法，根据上述方法培育获得的中华鳖伪雌鳖，再和表型、基因型均为雄性的中华鳖交配受精、人工采卵孵化，最终获得的后代为全雄中华鳖。
[0008] 本发明创新之处在于：结合了两种影响中华鳖性别发育的外界因素，在不同阶段对中华鳖进行性别控制或诱导，来提高基因型为雄性表型为雌性的伪雌中华鳖数量；并通过伪雌鳖与表型和基因型均为雄性的真雄鳖交配来得到全雄中华鳖后代。
[0009] 温控阶段：本实验设置六个孵化温度，分别是22°C、25°C、28°C、30°C、32°C、35°C，每个指标设一个重复，每组100枚，设置一对照组，在孵化室内常温孵化。所有卵均为同一晚产出，均重为5. I克，受精率92%。孵化基质沙粒经阳光暴晒5小时，实验组放恒温培养箱内孵化，孵化期间每天喷洒与砂温度相近的水。孵化箱的相对湿度保持在85%左右，温度由恒温箱控制不变直至出壳。由于性别分化主要是在孵化前期进行，孵化后期最宜在正常温度下进行，以利于稚鳖出壳生长，判断出甲鱼改变性别的关键时期。因此，根据中华鳖卵 的孵化积温值，25天后对在35°C、32°C、30°C、28°C下的卵移出恒温箱至孵化室进行孵
化出壳。50天后对在25°C、22°C下的卵移出恒温箱至孵化室进行孵化出壳。
[0010] 药物诱导阶段：对25°C -35°c孵化出来的稚鳖用17β-雌二醇进行诱导，将17 β -雌二醇分别以30mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、65mg/kg浓度的添加量到饲料中进行投喂诱导，分别诱导30天。其余的养殖条件与稚鳖的正常培养方法一致。
[0011] 本发明具有以下有益效果：
[0012] I、采用本发明的方法，可以得到较大数量的雌性中华鳖，为培育全雄中华鳖提供足够数量的亲本群。
[0013] 2、采用本发明的方法，可以获得全雄中华鳖后代，免去了人工进行筛选所花费的时间和劳动力成本。
[0014] 3、本发明的方法给出了温度和药物对中华鳖性别分化及影响的关系，为进一步研究中华鳖性别分化机制及采用生物技术方法进行性别控制奠定基础。
具体实施方式
[0015] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0016] 实施例一：
[0017] 一、受精卵采集
[0018] I、所有孵化用具都应进行消毒处理或暴晒杀菌；
[0019] 2、在集卵箱中放一层比较干的细沙；
[0020] 3、对人工产卵沙池全面翻砂采集，采集完后整理好沙池，以便亲鳖下次产卵；
[0021] 4、采集的鳖卵需在沙内暂放2-3天时间，以便在正式孵化前清除未受精卵；
[0022] 二、受精卵的鉴别
[0023] 经过暂放2-3天的鳖卵，已经明显分化出动植物极，分界清晰，卵壳光亮，白色的动物极占据鳖卵的大部分，到达卵壳中线稍偏下位置的为受精卵，否则为非受精卵。
[0024] 三、受精卵孵化
[0025] 方式：“地层式”，孵化室内首先在地下铺一层厚黄土并压紧，摆受精卵前应放一层3厘米的干细沙，（黄土和沙都应消毒或暴晒处理）。孵化箱内孵化操作类似于孵化室，即在箱底铺层细沙。摆放时应动物极朝上，两层为宜。
[0026] 四、孵化期间管理[0027] I、温度的控制，将中华鳖卵埋在装满细沙的塑料盆中，分别放置于温度为22°C、25 V、28°C、32 V和35°C的恒温孵化箱中孵化；采用在恒温孵化箱内洒水和在孵化盆的细沙表面喷水的方法来维持孵化湿度，使其相对湿度保持约85%。先干后湿，前20天只需保持少许的湿度，出苗期间无需喷水；
[0028] 2、每天需保证孵化箱内（早、中、晚各一次）通风换气，以便卵的呼吸；
[0029] 3、观察孵化期间卵壳颜色的变化：淡黄色-出现白色区-白色区扩大至中线偏下-暗黄色-淡紫红-紫红-乌黑色-乳白色，此时胚胎发育完成，稚鳖即将出壳。
[0030] 五、出壳后管理
[0031] 稚鳖刚出壳时十分幼嫩，不宜立即入池，应放在光滑的陶瓷或塑料盆中用清水暂养（一个直径40厘米的盆可暂养稚鳖20只左右），经常换水，及时清除脱落的脐带，12?24小时后，待稚鳖脐带完全脱落、收缩后，再放入暂养池或稚鳖池养殖；入池前应剔除脐带未收好、质量差的稚鳖；这个阶段无需投食。
[0032] 六、稚鳖放养
[0033] I、放养前鳖体消毒：用2%食盐水浸泡稚鳖10分钟，或15?20克/米3高锰酸钾溶液浸洗消毒15?20分钟，或聚维酮碘30克/米3，浸洗15分钟；
[0034] 2、放养时的注意事项：鳖苗转运时每箱不要装得太多，以免相互挤压，过度撕咬、抓伤（每箱放适量切碎的水葫芦可减轻鳖苗间的撕咬、抓伤）；放养时沿池塘四周均匀投放，切不可只集中投放在几处，因为鳖苗体质弱，活动能力差，往往不会自行分散游走；
[0035] 3、放养后3小时内全塘均匀泼洒硫醚沙星O. 6mg/L或聚维酮碘I. 5mg/L,以促进鳖苗体表创伤的愈合，防止继发性感染白斑病；第二天再用同样剂量重复一次，下塘后一周内很关键，决不可用刺激性大的漂白粉、强氯精等药物，因为这类药物在杀菌的同时，也可杀灭塘中的藻类；
[0036] 七、放养后的日常管理
[0037] I、在饲料中添加鱼肝油、VE、VC、复合维生素B，增强鳖苗的体质，以促进鳖苗对真菌的抵抗力；鱼肝油、VE、VC、复合维生素B可长期添加；
[0038] 2、抗菌药物的添加：在饲料中添加适量抗菌药物（如强力霉素、诺氟沙星、氟苯尼考等）在放养后投喂5天，以避免因放养操作时鳖苗体表损伤而引起的感染，同时促进体表创伤的愈合；
[0039] 3、水质的管理：放养后一个月内以保水为主，不要出水；随着吃料的增多，塘水逐渐变肥，可根据各塘的具体情况，适当排水。在养殖过程中保持优良的水质，保持PH值7. 5?8. 5,氨态氮< lmg/L,透明度15?25cm, C0D30mg/L左右,严格调控水质,避免水质恶化；
[0040] 4、巡塘：早晚巡塘，观察水温、水质及鳖苗的活动、爬板情况，一旦发现异常情况，应及早采取措施；
[0041] 5、投料管理：糜状饲料拉成细条状离水面Icm左右均匀投放在饲料板上。仔细观察鳖苗的吃料情况，及时调整投饵量，做到定时、定量、定质、定点投喂，剩饵收捡干净，以防败坏水质；每隔3天用20mg/L漂白粉消毒一次，杀灭饲料板上的青苔、钟形虫及病原体。
[0042] 八、药物诱导
[0043] 稚鳘开口后，就开始进行药物诱导，分别以30mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、65mg/kg浓度的添加量到饲料中进行诱导，分别诱导30天，将稚鳖饲养到个体性别特征较明显时，进行性别的鉴定。雌鳖尾部较短，不能自然伸出裙边外或外露很少，体型圆，体高，背甲呈卵圆形，前后基本一致，腹部中间的软甲，十字形后肢间距较宽；雄鳖尾部较长，能自然伸出裙边外，体型稍长，体高隆起而薄，背甲呈长卵圆形，后部较宽，腹部中间的软甲，曲玉形，后肢间距较宽较窄。
[0044] 幼鳖阶段：数据统计得出，在孵化期恒温25°C，稚鳖期45mg/kg雌性激素进行30天诱导的雌雄比例为144 ： 36，为雌鳖产出最多，而对照组的雌雄
比例为81 ： 84。并比以往单独因素诱导性别转化的效率要高。
[0045] 亲鳖培育与全雄后代繁殖：对孵化期恒温25°C，稚鳖期45mg/kg雌性激素进行30天诱导的雌性中华鳖（中华鳖真伪雌鱼）进行标记培育，性成熟后与表型和基因型为雄性 的中华鳖进行交配，发现有62只表型为雌性的中华鳖与表型和基因型为雄性中华鳖的后代为全雄个体。具体数据通过分析如下，将144只雌性中华鳖进行编号（01-144)，分别饲养，并以I : 7的雌性比例进行繁殖，观察子代表观特征可以得出共有62只雌性中华鳖的后代为全雄中华鳖.其余82只雌性中华鳖的后代雌雄比例接近I : I。
[0046] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
公开号 CN102763625 A
发布类型 申请
专利申请号 CN 201210272593 公开日 2012年11月7日 申请日期 2012年7月28日 优先权日 2012年7月28日
公开号 201210272593.8, CN 102763625 A, CN 102763625A, CN 201210272593, CN-A-102763625, CN102763625 A, CN102763625A, CN201210272593,
CN201210272593.8
发明者 夏建海, 戴振炎, 熊钢, 王晓清, 马晓 申请人 湖南农业大学 权利要求(3)
1.中华鳖伪雌鳖的培育方法，其特征在于，包括受精卵的孵化和稚鳖诱导，受精卵的孵化温度为25°c，刚孵化出的稚鳖用17 β-雌二醇进行投喂诱导而得到中华鳖伪雌鳖，17 β -雌二醇浓度为45mg/kg饲料。
2.根据权利要求I所述的中华鳖伪雌鳖培育方法，其特征在于：对稚鳖用17β-雌二醇按照45mg/kg饲料的浓度进行药物诱导30天。
3.全雄中华鳖的培育方法，根据权利要求I或2所述的方法培育获得中华鳖伪雌鳖，再和表型、基因型均为雄性的中华鳖交配受精、人工采卵孵化，最终获得后代为全雄中华瞥
中华鳖伪雌鳖及全雄中华鳖的培育方法
