第三章 中药药效学研究的基本要求与方法
第一节 中药药效学研究的基本要求
中药新药的基本要求是安全、有效、质量可控和稳定。药效学是中药新药研究与开发的重要内容。
一.药效学研究的基本目的
(一)通过药效学研究确定有效性
通过药效学研究可以初步明确新药是否有效,作用的强弱,与同类药比较在药效上的优缺点和特色,确定有无实用价值及开发前景,结合毒理学研究结果,确定可否进行人体试验及临床研究。
(二)提高临床疗效
通过作用机制研究及配伍规律研究,可以揭示药物作用的物质基础和作用原理,使临床使用充分发挥药物特色,提高临床疗效。中药新药的药效学研究应充分运用现代科学特别是现代医学的理论、方法和手段,制定科学、严密、具有中医药特点的试验计划。根据新药的特点、功能主治、临床实践经验及近年研究成果,合理选用试验方法,建立与临床相符的 “病” “症”或“证”相似的动物模型与指标,对新药的有效性作出科学的评价。 对天然药物及中药中提出的单一化合物不强求用中医药理论来指导 二.药效学基本要求
(一)试验负责人
应是具有药理、毒理专业高级职称和有较高理论水平、工作经验与资历的人员。确保试验设计合理,数据可靠,结论判断准确。试验报告应有试验负责人签名及单位盖章。
(二)受试药物
应处方固定、制备工艺及质量基本稳定。 (三)研究单位
从事新药安全性研究和药理研究的实验室应符合国家《药品非临床研究质量管理规范》GLP (Good Laboratory Practice)的要求。具有较高的科研水平、技术实力,组织管理,具有较好的客观条件,其实验室、仪器设备、药品试剂等,均应符合要求。
(四)实验动物
应符合国家规定的要求,种属、性别、年龄、健康状况、饲养条件、动物等级、特殊模型动物等,均应符合试验要求。
(五)试验记录
1.记录要求:实验记录应真实、完整、详细、准确、规范,防止漏记和随意涂改,对试验中出现的新问题和特殊现象应详细写明情况。描记和形态学检查应有记录图和照片。不得伪造、编造数据。记录应符合国家《药品研究实验记录暂行规定》的要求。
2.记录内容:
实验名称:每项实验首先记录课题名称及实验名称。
实验方案:实验方案是进行实验的依据。实验首页应有一份详细的实验设计及方案。 实验日期:每次实验须记下年、月、日及时间。
试验动物:种属、性别、年龄、数量、健康状况、提供单位、合格证,动物等级或特殊模型动物、饲养管理、试验前观察与处理,随机分组的方法。
试验用药:品种、学名、产地,提取工艺,药物含量、浓度,给药剂量与容积,给药途径、次数、时间。阳性对照药的选择依据、处方、功能主治,生产厂家名称,批准文号,生产批号及出厂日期,实验前预处理,有无特殊溶媒、基质、防腐剂、助溶剂、填加剂等。试验用其他药品试剂的品名、规格、生产厂家、批号等。
主要仪器及试验用品:型号、规格、性能、生产厂家及批号等。
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试验方法:说明参考文献的来源,主要操作程序(动物麻醉、固定、手术、观测等),观测指标(取样、测试、记录、计算、统计等),以及每只动物的原始记录、数据、图谱等,各组原始数据的统计、分析、比较结果。
试验结果:制表、绘图,分析判断,获得准确可靠的结论等。
试验记录应准确无误,不得任意取舍或涂改,试验中出现的特殊现象、矛盾结果等,均应详细记录。
此外,实验室的温度、湿度(必要时气压),实验的时间(必要时注明白日或黑夜),以及可能影响试验的环境因素,均应详细记录。
实验负责人、参加者、单位等亦应记录。所有试验记录,均应妥善保存,保管人姓名、单位。随时准备上级检查。
(六)统计处理
试验结果应进行正确的统计学处理,统计方法应说明。数据表格应规范。资料整理应简明扼要,注意科学性、严密性、逻辑性,真实可靠地反映出试验所获得的各种信息与结果。
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第二节 药效学研究的方法
一.实验设计原则
实验设计应该符合中药特点;符合国家新药研究申报的有关规定;遵守“随机、对照、重复”的原则。
二.动物选择
1.种类:动物选择敏感动物,对药物的反应与人体近似,以进化程度较高,解剖、生理、习性及反应性与人相近的动物为佳。能够大量繁殖供应,价格便宜的动物。灵长类动物(猴、猩猩)最近似人类,但价格昂贵、难得、需特殊饲养。实验常用小鼠和大鼠,易繁殖和饲养、价廉、耗药量少。豚鼠易于致敏,对组胺非常敏感,适于做过敏试验。家兔对体温变化十分灵敏,常用于热源检查和解热试验。猫、狗、大鼠血压稳定,常作为血压试验。大鼠和狗常于毒理学研究。猪由于解剖和生理上与人相似,近日选用逐渐增多。
2.品系:不同品系动物对药物的敏感性不一。例如A、C3H、津白Ⅱ小鼠易致癌,AKR、DBA/2、L615易致白血病,C3H雌鼠乳腺癌自发率达90%,AKR小鼠白血病自发率达65%。目前最常用动物为昆明种小鼠,Wistar大鼠、SD(Sprague Dawley)大鼠、青紫蓝兔、新西兰兔和日本大白兔、豚鼠等。
3.动物等级:实验动物应选用符合等级要求的健康动物,并有供应单位合格证。我国将实验动物分为4级:一级动物即普通动物(CV);二级动物即清洁动物(CL);三级动物即无特定病原体动物(SPF);四级动物即无菌动物(GF)和悉生动物(GN)。目前我国药理学实验大多采用普通级动物(CV动物)和清洁级动物(CL动物)。
4.年龄:常用性成熟年龄动物,小鼠为6~8周龄,大鼠8~9周龄,豚鼠6~10周龄,兔4~5月,猫6~8月,狗6~8月。常选用成年小鼠体重为18~22g,大鼠200g(150~250g),家兔2kg(1.5~2.5kg),猫2~3kg,狗8~10kg,猴8~15kg。必要时选用特定年龄、体重动物。
5.性别:一般试验选用雌雄各半动物。某些试验选一个性别动物。例如热板法镇痛试验选用雌性小鼠,而不用雄性小鼠。
6.数量:每组试验动物数应符合统计学要求。药效学计量学统计试验每组试验动物,一般小鼠不得少于10只,大鼠为8只,猫、狗为4只以上,以便进行统计学处理。用小鼠、大鼠计数资料试验动物数则要求更多。
三.方法的选择
根据主治,参考功能,选择相应试验方法。针对性强、重点突出、主次分明。既可对新药有效性作出科学、准确的评价,又可避免走弯路,免作大量无关的或不说明问题的试验,减少大量人力物力及时间的浪费。由于中药常具有多方面的药效或通过多种方式发挥作用等特点,应选择相应的方法证实其药效。
在选择试验方法时,应注意以下问题: (一)根据主治,参考功能,选择试验方法
根据主治,参考功能,选择试验方法,这是适用于多数中药的基本经验。个别情况下也可根据
功能选择试验方法。但要注意,目的性明确、针对性强,避免盲目选作大量无关或关系不大的试验,劳而无功。
(二)首选具有中药特点的试验方法及动物模型 首选符合中医理论,具有中药特点的试验方法及动物模型,其次可选用现代医药学合适的方法 及模型。
(三)主要药效为主,配合辅助试验
直接证实主要药效的核心试验(或主要试验)为必作项目,可选作不同模型、方法、动物
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及给药途径的试验2—3项。而间接证实主要药效或次要治疗作用的外围试验(或辅助试验)为选作项目,可根据新药的特点,功能主治及已有的临床经验,酌情选作几个方面的药效试验,每个方面选作1—2项试验即可。一般情况下,绝大多数药物应以核心试验为主,是评价新药有效性的主要根据,适当配合辅助试验,有助于全面、准确的评价其有效性,但不可用外围试验取代核心试验。
(四)试验方法的选择
试验方法的选择应强调科学性、先进性、重复性、目的性,必须有针对性的精选试验,不可盲目的以多取胜。
(五)整体和离体方法选择
中药由于成分复杂,特别是复方粗制剂,为多种化学成分(或有效部位)的混合体,除有效成分外,尚有一些无关成分及干扰成分。如无特殊情况,给药途径应与临床给药途径尽量一致。中药粗制剂药效学试验应以体内试验为主,体外试验为辅,以消化道给药为主,其他给药途径为辅。
四.指标的选择
选择符合要求的观测指标,才能反映出药物对机体的影响,进行新药有效性的评价。指标符合以下要求:
(一)特异性强
任何试验都应选用针对性强,专属性好,能够反映变化本质及主要药效的指标。 (二)敏感性高
指标要敏感,对于病情及症候的任何变化,对于药物的防治作用,能够敏感、准确的反应出来。而敏感性差的指标,往往会遗漏某些阳性变化,而造成假阴性结果。
(三)重现性好
指标要稳定,重现性好,结果才可靠。若重现性差,则应检查是动物不合要求,模型不合理,方法不可靠,还是观测指标有问题,检测记录不准确,误差太大,或是干扰因素太多等原因所致。否则,重现性差的试验结果不可靠,不能作为新药有效性评价的依据。
(四)客观性
主观检测的指标,误差较大,不够准确,例如肉眼观测血压计水银柱的变化,误差较大,而用描记仪直接描记血压曲线,客观的、动态的记录血压变化,则更为精确。
(五)定量指标
为了准确判断药物的作用及机体的变化,必须有量的概念、量的比较,必须选用可测量的定量指标(即计量指标)。例如形态学指标(如组织学、病理学指标),其特点是能够准确的定性、定位,但难于定量,常需采用定量组织学方法,使之定量或半定量,更准确的判断药物的作用及机体的反应。但有些质反应指标只能反映是与否、死与不死、阴性与阳性,只能用计数指标。也有的指标目前尚无计量方法,可用分级定度打分的办法,使之定量化。
(六)多指标综合运用
各种指标均有其优点,也常有其局限性,或不足之处,一项观测指标很难满足上述多方面的要求。为了准确、全面地判断新药的有效性,常需多指标综合运用,以取长补短,相辅为用,例如生理指标可定性定量,进行连续动态观察,但有时定位欠准,可受多种因素干扰,稳定性较差。而形态学指标,则可定性定位,但难于定量,也难于进行连续的动态观测。各有优缺点,若生理、生化、形态等各类指标合理搭配,综合运用,则试验结果更为全面、准确、可靠。有些指标单一使用即可达到试验目的,满足要求,则不必为“多而全”而勉强采用多指标观测。应具体情况具体分析,根据试验目的与要求,优选指标,不是“越多越好”,而是“越说明问题越好”。
五.药物的要求
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供试药物是药效学研究的对象,是新药有效性评价的物质基础。供试药物不合要求,各项试验无法获得正确结果。因此,供试药物,应处方固定,各味药材经过品种鉴定,生产工艺基本定型,质量标准及稳定性试验基本符合要求,与临床用药基本相同的剂型与质量。凡是药材未经鉴定,处方、生产工艺、质量、剂型等尚未固定,或有变动者,不宜用作药效学试验。
消化道给药:包括灌胃、胃管、十二指肠给药等,可用制剂或提取物进行药效学试验。前者与临床用药更为相似,更合理,但因制剂含有大量糊精、蔗糖等赋型剂,水溶后呈粘稠状,灌胃不便,且体积大,含药量低,无法浓缩提高含药量,因而难于提高动物用量。所以在较多情况下,常用中药提取物进行试验。两者各有利弊,可依具体情况而定。
注射给药及试管内给药:对供试药物要求较高,应是化学纯品或精制的中药制剂,尽量除去杂质、不溶成分及无关成分,其溶解性、粒度、渗透压、酸碱度、无机离子含量(钠、钾、钙、镁等)以及可能干扰试验结果的各种因素,均应控制在生理范围内或符合注射剂基本要求。否则,注射给药将引起机体非特异性反应,产生一系列假象,误认为药理作用:试管内给药也会出现假阳性结果,造成错误判断,其结果须认真分析,慎重判断,且仅能供参考,不能作为新药有效性评价的主要根据。
外用药:包括擦剂、洗剂、贴剂、膏药等。一类是用于治疗体表或局部疾患,如皮肤病、疖肿、跌打损伤或局部肿痛、骨折等;另一类则是局部用药治疗全身性疾患,例如局部或穴位贴药治疗哮喘、冠心病、高血压等,两者用药目的不同,试验方法及给药方式也不完全相同。两者均可用制剂(含基质的成品)或中药提取物(不含基质的半成品)进行试验,以外用给药的方式为主,可依涂药面积大小,或含药浓度高低,或给药次数多少等方式,设立高、中、低给药剂量组。“内病外治者”,外用药应进行透皮吸收试验,以了解药物渗透吸收的速度与数量,有助于准确评价其药效。可以口服的复方中药,改为内病外治,应与口服进行药效学对照比较。外用药以制剂进行试验者,若制剂中含有特殊溶媒或基质者,除设空白对照外,尚应设溶媒或基质对照,以了解其作用和对主要药效的影响。
其他:眼、耳、鼻、吸入剂及腔道内给药(如直肠、阴道、气管内、腹腔、胸腔等)对药物也有严格要求,特别是气雾剂、吸入剂及腔道内给药,供试药物的要求基本与注射剂相同。
六.给药途径与容量
给药途径:给药途径应与临床相同。例如口服制剂动物可采用灌胃、十二指肠给药。如有困难可选用其他给药途径进行试验,但应该说明原因。有时动物试验采用临床相同的给药途径,无法作出结果,或确有困难者,可根据具体情况采用相似的其他给药途径进行试验。例如口服药进行心脏血流动力学试验难于显示结果,可改用注射给药(粗制剂可适当精制后,皮下、肌肉或腹腔注入,不宜静脉给药,除非供试药物符合注射剂要求)。又如用大鼠或小鼠进行连续多次或长期静脉注射或静脉输注给药时,困难较大,可酌情改用皮下、肌肉或腹腔注射(有刺激性者不宜进行腹腔注射),或换用大动物(犬、猴等)进行试验。凡是因特殊情况采用不同于临床用药的给药途径进行试验时,应认真分析试验结果,排除可能存在的干扰因素及假象,充分估计不同给药途径可能产生的影响,正确判断试验结果,或其结果仅供参考,不能作为新药有效性评价的主要根据。
给药容量:根据用药剂量而定。但应当适宜。容量过大、过小都不适宜,易出现实验误差甚至假阳性或动物死亡。
禁食不禁水12~16小时,小鼠每次常用灌胃(ig)容量0.1-0.2ml/10g体重,不超过0.4ml/10g体重,最大为1ml/只(禁食不禁水12~16小时);皮下(sc)、腹腔(ip)、静脉注射(iv)不超过0.5ml/只。
大鼠禁食不禁水12~16小时,每次灌胃容量一般为1~2 ml/100g(体重),最大-般不超过5 ml/只;腹腔注射1.5ml/只;皮下和静脉注射不超过1ml/只;肌肉注射0.4ml/只。
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第三章 中药药效学研究的基本要求与方法
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