线粒体基因全分析及进化树的构建毕业论文

由天下分享时间：2025/1/2 18:59:49 加入收藏我要投稿点赞

1、前言（Introduction）

英国《自然》杂志网络版2006年5月18日报道，科学家已对含有2.23亿个碱基对，占人类基因组中碱基对总量的8%左右的人类第一号染色体完成测序，宣告持续16年的人类基因组计划全部完成。作为人类自然科学史上重要的里程碑，“人类基因组”的研究已从“结构基因组”阶段进入“功能基因组”阶段。在人类基因组计划后相继推出的水稻基因组计划、马铃薯基因组计划、草鱼基因组计划等，和快速增长的微生物基因测序，“海量”的基因信息的积累，催生了“功能基因组”时代的来临。针对充分利用“海量”基因组信息的生物信息学不仅应运而生，而且为以注释、阐明基因功和利用基因生物学功能的“后基因组时代”的研究发挥了重大作用。

生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头,在获得了蛋白质编码区的信息后,进行蛋白质空间结构的预测和模拟,然后依据特定蛋白质的功能进行必要的药物设计。就是说,生物信息学的主要任务是组织和分析生物学数据,而生物学数据的分析离不开计算机算法的运用。因此,可以说生物信息学是一门集生命科学、计算机科学、数学、物理学为一身的多学科交叉的前沿学科。

动物mtDNA属母系遗传，是共价闭合的双链DNA分子，核酸序列和组成比较保守，基因的排列顺序比较稳定而且紧密，无重组和单拷贝。由于其结构和进化上的特点，mtDNA已成为研究动物起源进化以及群体遗传分化的理想对象。昆虫mtDNA大小约为15．4~16．3kb，其基因组大小的变化受A+T-rich区长度变化的影响十分显著。A+T-rich区(A+T丰富区)的长度最短为399 bp，最长达4601 bp，两者相差4202bp，前者见于Tricholepidion gertschi，后者见于黑尾果蝇Drosophila melanogaster。昆虫线粒体基因组由2个rRNA基因(1rRNA和srRNA)、22个tRNA基因、13个蛋白编码基因[Cytb基因(细胞色素b基因，cytochrome oxidase b)，ATPase6和ATPase8(ATP酶亚基基因6和8，ATP synthase subunits 6 and 8)，COⅠ、COⅡ和COⅢ(细胞色素氧化酶亚基基因Ⅰ-Ⅲ，cytochrome oxidasesubunit Ⅰ-Ⅲ)，NDl-6和ND4L(NADH降解酶基因1~6和4L，NADH dehydrogenase subunit 1-6 and 4L)]，共37个基因和1个包含复制启动子的非编码区(A+T-rich区)组成。Aloni 和 Attardi将mtDNA两条链中密度较小者命名为轻链(L链)，另一条命名为重链(H链)。考虑到昆虫mtDNA没有明显的L链与H链之分，Simon等根据昆虫mtDNA中多数基因都是从一条链上转录的特点，将这一条链定义为J链，另一条链定义为N链[1-3]。

自Wolstenholme和Clary第一个报道了果蝇Drosophila yakuba mtDNA全序列以来，GenBank已收录了80余种昆虫mtDNA全序列，其中双翅目昆虫有15个种。在双翅目实蝇科昆虫中，地中海实蝇Ceratis capitata和油橄榄果实蝇Bactrocera oleae的线粒体基因组全序列已有报道[4]。

梨小食心虫，学名Grapholitha molesta (Busck)，简称“梨小”，别名有梨小蛀果蛾、东方果蠹蛾、梨姬食心虫、桃折梢虫、小食心虫、桃折心虫。属于鳞翅目(Lepidoptera)，

小卷叶蛾科(Olethreutidae)。梨小在各地果园均有发生，是梨树的重要害虫，在梨、桃树混栽的果园为害尤为严重。梨小除为害梨、桃树外，也为害李、杏、苹果、山楂等，严重影响果品质量及梨果产量，尤其是长江、黄河流域最严重[5]。

因此，我的论文是通过NCBI下载的梨小食心虫的全线粒体基因，并对其结构和功能进行分析。

2、材料和方法（Marerials and Methods）

2.1、研究思路

2.2、搜索基因

2.2.1、在NCBI中搜索梨小食心虫线粒体全基因序列

方法：

首先进入NCBI的官网，在Search中选择All Databases,在查询框中输入Grapholita molesta mitochondrion，点击Search,然后选择Geneome,总共出现一条记录，即选择NC 014806, Display 选择为Genbank,选择Download中的Genbank格式，即可下载得到梨小食心虫的线粒体全基因序列。

2.2.2、用DNAMAN分析其基因结构

得出结论梨小食心虫线粒体基因的结构和功能分析进化树的构建梨小食心虫线粒体蛋白质序列 1、蛋白质一级结构分析 2、蛋白质二级结构分析 3、蛋白质三级结构分析 4、蛋白质功能性质分析梨小食心虫线粒体基因序列 1、基因序列的获取 2、基因序列的分析 3、同源性分析 4、开放阅读框的分析与同源性最相近的物种进行进化树的构建对于获取的海量数据，我们要先进行一些基本的分析，确定基因的分子量、碱基的组成等信息。

方法：

选取梨小食心虫的线粒体基因，选取显示的方式为包含cds,点击确认，即可。 2.2.3、碱基同源性分析的方法

方法：

进入网址：，在序列中提交NC 014806，其他选项默认设置。

通过在线的BLAST的比对，可以找到与梨小食心虫线粒体同源性最高的物种，从而可通过研究其同源性高的物种，间接研究该物种，为该物种的进一步研究提供一定的理论依据。

2.2.4、开放性阅读框（ORF）分析的方法

方法：

利用NCBI的ORF Finder程序对NC 014806做开放性阅读框分析。网址如下：

参数选择：Genetic Codes：1 Standard

开放阅读框[open reading frame,0RF] 是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。

ORF的识别是证明一个新的DNA序列为特定的蛋白质编码基因的部分或全部的先决条件[6]。

通过ORF的分析，我们可以确定全基因中哪段基因片段可以翻译为蛋白质，从而为特定蛋白质的功能的确定提供依据。

2.3、基因编码蛋白质的理化性质分析

利用ExPaSy中的Protparam和Protscale进行蛋白质的氨基酸组成、分子质量、等电点以及疏水性分析[7]。

2.3.1、氨基酸组成、分子质量、等电点分析方法

利用ExPaSy软件包中的Protparam工具进行氨基酸组成、分子质量、等电点分析网址如下：

通过氨基酸组成、分子质量、等电点分析，我们可以确定编码蛋白的最基本性质，为进一步研究蛋白质的二级结构、三级结构提供依据。 2.3.2、亲疏水性分析方法

利用瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics， SIB）的ExPASy服务器上的ProtScale程序对ORF 翻译后的氨基酸序列SEQUENCE进行亲疏水性分析

网址如下：

参数选择：

Hphob. / Kyte & Doolittle

正值表明疏水，负值表明亲水。通过疏水性分析，可以让我们了解蛋白质是否属于亲水蛋白。

2.4、基因编码蛋白质的结构分析

2.4.1、蛋白质的二级结构分析

方法：

利用Expasy服务器下的SWISS-MODEL中的Psipred进行蛋白序列的二级结构分析网址：

http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=tools_targetidentification1 蛋白质二级结构:指蛋白质肽链本身的折叠和盘绕的方式。二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角。常见的二级结构有α-螺旋和β-折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的，氢键是稳定二级结构的主要作用力。

蛋白质二级结构预测，是通过氨基酸序列，预测蛋白质二级结构的过程。氨基酸序列具有不同的长度，不同的氨基酸排列顺序。实验分析表明这种差异能够形成不同的蛋白质结构。研究蛋白质的结构意义重大，不但有助于了解蛋白质的作用，了解蛋白质如何行使其生物功能，认识蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而且对生物学、医学和药学都有非常重要的作用[8]。

2.4.2、蛋白质的三级结构分析

方法：

将分析的结果向蛋白质立体结构数据库PDB ( Protein Data Bank)提交该蛋白质序列，利用RasMol软件显示该蛋白的三维分子结构

蛋白质三级结构（protein tertiary structure）: 蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕，折叠形成的。三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用，氢键，和盐键（离子键）维持的。此外共价二硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起着重要作用。

通过研究蛋白质的三级结构，可以让我们更直观的通过其结构了解其功能性，从而为蛋白质功能的确定提供有力的依据[9]。

2.5、基因编码蛋白质的功能分析

2.5.1、信号肽预测的方法

方法：

利用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器蛋白质序列的信号肽（signal peptide）预测，进入Prediction Serves 页面。

网址如下：参数选择：

Eukaryotes；Both；GIF (inline)；Standard

信号肽，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端）。

信号肽位于的N端。一般由15~30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要；一个较长的带的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区。

信号肽的作用，可使正在翻译的核糖体附着到RER膜上，还可以在信号肽指引下蛋白质在细胞内[10]。

通过信号肽的预测，可以让我们知道蛋白质是如何跨膜转移的。 2.5.2、磷酸化位点分析的方法

方法：