霉菌实时荧光核酸恒温扩增检测技术研究
孙皖如1，马玉帅1，许向华2，乌日琴3，张玉妥1
【摘 要】摘要：以霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列作为靶序列设计引物，合成分子信标探针；以黑曲霉菌ATCC(16404)DNA为模板，通过PCR、分子克隆、转录构建靶标RNA，进而建立实时荧光核酸恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing，SAT)，并对体系内相应成分进行优化；最后利用优化的SAT体系检测食品污染中常见的病原微生物，评价SAT方法的特异性；针对不同浓度的黑曲霉菌孢子悬液，提取RNA进行SAT检测，评价SAT方法的灵敏性。结果表明，SAT检测体系中引物浓度为10 μmol·L-1及探针浓度为10 μmol·L-1时，反应曲线最佳；扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与培养的黑曲霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-7.061x+59.567，R2=0.961 1)，该方法的灵敏度为103个·mL-1孢子，用该方法检测食品中常见污染菌，发现仅黑曲霉菌出现荧光信号。初步建立了黑曲霉菌的SAT检测体系，可与食品常见污染细菌相鉴别，特异性达100%，进一步提高灵敏度后，可成为食品中黑曲霉菌检测的新方法。 【期刊名称】《河南农业大学学报》 【年(卷),期】2019(053)005 【总页数】8
【关键词】实时荧光恒温检测技术；黑曲霉菌；核糖核酸 (RNA) 基金项目：张家口市重大科技成果转化项目(1811002A)
真菌导致食品变质占全球粮食产量损失的5%～10%，除了造成食品产量巨大损失外，更加严峻的是食品安全问题。真菌在代谢过程中会产生容易引起人和
动物病理变化和生理变化的次级代谢产物，如黄曲霉毒素等真菌毒素[1]，导致人和动物急性或慢性中毒。因此，建立可行的检测方法，快速准确地检测粮食中的霉菌已成为食品安全监督的重要环节，是保障食品安全和预防食源性疾病的主要手段之一。目前对食品中霉菌的检测方法有传统培养法、生化检测法、代谢学检测法、实时光电微生物检测法、流式细胞技术法、分子生物学检测法等。传统培养法也即国标法，其结果准确、真实可信，但检验周期比较长，敏感度低，适用于实验室检验[2]；生化检测技术常用于现场检测，价格低廉且适用范围广，但存在计数不准的问题[3-4]；代谢学技术适用于特定产品的大批量检测，特异性强、重复性好，但检测结果易受到多种因素干扰且检测设备价格昂贵[5-6]；实时光电微生物检测技术适合保存期短的样品的检测[7]；流式细胞技术检测指标系统全面，灵敏度高，但由于仪器价格高且要求较高的操作技术，一般用于实验室进行科学研究[8]；用于霉菌检测的分子生物学技术主要是实时荧光定量PCR技术，以其快速定量、无需电泳、无交叉污染等突出优点而被广泛采用[9]，但假阳性率较高。实时荧光核酸恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing,SAT)是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。其原理为同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸(RNA)的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个(102～103个)RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况。SAT检测的靶标为RNA，由于RNA随着菌体死亡而很快降解，故检测结果可避免“死菌”的干扰，更能客观反映标本中微生物污染情况。根
据靶标核酸设计的引物和分子信标，实现特异性扩增和检测，可有效防止假阴性的结果[10]，进一步提高了检测的特异性。每一个循环可以扩增102～103倍的模板，具有更高的扩增效率和灵敏度。而恒温扩增，降低了对仪器的要求。由于特异性好，灵敏度高，快速准确，SAT成为最有前景的检测方法之一。SAT已广泛用于临床上细菌的检测，但未见用于真菌检测的相关报道。根据GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》霉菌的阳性对照菌株是黑曲霉菌，本研究建立黑曲霉菌检测的SAT技术，为食品中霉菌的检测提供一种方法学探究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑曲霉菌标准菌株(ATCC16404) (购自上海北诺生物有限公司)；金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、蜡样芽胞杆菌(ATCC27853)、大肠埃希菌O157:H7(ATCC700728)、志贺菌(ATCC25286)、沙门菌(ATCC13090)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、白色念珠菌(ATCC10231) (河北北方学院微生物教研室惠赠)；马铃薯葡萄糖琼脂培养基含氯霉素(PDA)、营养琼脂斜面培养基、肉汤培养基 (广东环凯微生物科技有限公司)；真菌RNA提取试剂盒 E.Z.N.A.TM Funal RNA Kit、细菌RNA提取试剂盒 E.Z.N.A.TM Bacterial RNA Kit OMEGA、质粒提取试剂盒、T4 DNA Ligase试剂盒 (北京天根生化科技有限公司)；Sal I酶 (宝生物工程有限公司)；DNA凝胶回收试剂盒、RNA清洁纯化试剂盒,北京百泰克生物技术有限公司；SAT酶、转录酶T3P10、Taq酶Bioscience,RD; SanDiego,USA；SAT反应液 (上海仁度公司提供)；天隆-988实时荧光PCR仪 (西安天隆科技有限公司)；干式恒温仪 (武汉艾维斯特科技有
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