第十三章细胞的衰老与凋亡复习题 本章的基本内容概要
1．细胞衰老：
细胞衰老是一种细胞的重要生命活动现象。然而对细胞衰老的认识却经历了一个曲折而漫长的过程，由早期的细胞“不死性”的观点发展到现今被普遍接受的细胞增殖能力和寿命有限的观点。Hayflick等人的研究证实：细胞至少是培养的细胞。不是不死的，而是有一定寿命的；细胞的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限。这就是著名的Hayflick界限。研究发现物种受命于培养细胞之间存在着正相关的关系，即物种的寿命越长，其培养细胞的传代次数越多，反之，其培养细胞的传代次数越少。对于在体外培养的二倍体细胞，是细胞核决定细胞的衰老；就细胞内外环境因素而言，是细胞内部因素决定细胞的衰老。在生活有机体内，细胞衰老和死亡是常见的生命活动现象。衰老的细胞分裂速度减慢，其原因主要是G1期明显延长，S期的长度变化不大。
细胞衰老的过程中，其结构发生一系列的深刻变化。包括：细胞核增大，核膜内折，染色质固缩，糙面内质网减少，线粒体变大并且数目减少，产生致密体，膜常处于凝胶相和固相，细胞间间隙连接减少，组成间隙连接的膜内颗粒聚集体变小等。这些形态结构的变化直接导致其相应的功能下降，关于细胞衰老的机制研究近年来取得重大进展，提出了氧化性损伤学说。有丝分裂钟学说等多种理论，但均未有最终结论。
细胞衰老并不等于多细胞有机体的衰老，两者既有区别又密切相关。 2．细胞凋亡
细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程。他普遍地存在于动物和植物中。在细胞凋亡发生的过程中，形态结构发生了明显的变化，如细胞表面微绒毛和细胞间接触的消失，内质网囊腔膨胀，染色质固缩，凋亡小体的形成，继而逐渐为邻近的细胞所吞噬并消化。整个细胞凋亡过程内含物不泄露，不引起炎症反应，这是凋亡与坏死的最大区别。DNA电泳形成的梯状条带是细胞凋亡的典型特征，这是检测细胞凋亡最可靠的一种方法。
诱导细胞凋亡的因子可分为两大类：一类是物理因子；一类是化学因子。一般认为，动、植物细胞的凋亡具有共同的或相似的机制，已经发现了一些与凋亡有关的基因和酶，但对凋亡的分子机制了解甚少。总之，细胞衰老与凋亡的关系是一个相当复杂的问题，两者既有联系又不相同，在长期的进化过程中形成的这种复杂机制对于维持生物体的正常功能是极其重要的。
本章学习要求：
1．理解Hayflick界限和细胞凋亡的概念以及他们的特征变化和发生的可能机制。 2．掌握细胞衰老、死亡和细胞凋亡的鉴定方法。 3．理解细胞凋亡的调控机制。
重点：细胞凋亡和细胞衰老的特征、区别和分子机制及他们的鉴定方法。
基本概念：
Hayflick 界限：是由Hayflick等于1961年发现的，他们的工作表明：细胞，至少是培养的细胞不是不死的，而是有一定的寿命的；他们的增殖能力不是无限的。细胞的这种寿限即为Hayflick界限。应注意：不同生物的细胞的Hayflick界限的时间是不同的。
生物自由基伤害学说：
是解释衰老机制的一种学说，其内容是：生物体在正常情况下，体内自由基的产生和清除，处于动态平衡状态，自由基维持在浓度很低水平，不会引起伤害。但在衰老或遭受某种环境胁迫时，体内自由基就会增多，是自由基的产生与清除之间平衡状态被破坏。当自由基浓度超过了一定阈值，则导致蛋白质、核酸、多糖和膜脂分子的氧化破坏。特别是膜脂中
的多不饱和脂肪酸最容易受自由基攻击而发生过氧化作用，进一步产生新自由基，促进膜脂过氧化，膜的完整性受到破坏，细胞内组分大量外漏，最后导致死亡。
细胞凋亡：又叫程序性细胞死亡，是细胞主动发生的自然死亡过程，或者说，是一个主动的由基因决定的结束生命的过程。可发生在生物体的生长发育直至死亡的整个生命过程及某些病理过程中。
Caspase:称作半胱天冬酶， Caspase是一种蛋白酶家族，成员较多，在人类，以鉴定了10种不同的Caspase。各种Caspase都富含半胱氨酸，被激活后，能够在靶蛋白的特异天冬氨酸残基部位进行切割。在正常细胞内，每一种Caspase都是以非活性状态存在的，这种非活性的Caspase称作酶原，是酶的非活性前体，其肽链比有活性时长一些，将多出部分切除，就转变成有活性的Caspase。有两类Caspase，一类是起始者，另一类是执行者，起始Caspase在外来蛋白信号的作用下被切割激活，激活的起始Caspase对执行者Caspase进行切割并使之激活，被激活执行者Caspase通过对Caspase靶蛋白的水解，导致程序性细胞死亡。
坏死：组织或细胞坏死是病理原因造成的被动死亡，坏死细胞的膜通透性增高，细胞肿胀，细胞器变形或肿大，最后细胞破裂。另外坏死的细胞将裂解释放出内含物，通常引起炎症反应。
凋亡小体：程序性死亡细胞的核DNA在核小体连接处断裂称核小体片段，并向核膜下或中央异染色质聚集形成浓缩的染色质块。随着染色质不断聚集，核纤层断裂消失，核膜在核孔处断裂形成核碎片。同时在程序性死亡过程中，由于不断的脱水，细胞质不断浓缩，细胞体积减小，凋亡细胞的核经核碎裂形成染色质块，然后整个细胞通过出芽、起泡等方式形成一个球形的突起，并在其基部绞断而脱落形成一些大小不等，内含胞质、细胞器及核碎片的小体成为凋亡小体。
细胞衰老：衰老是有机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现，是不可逆的生命过程。细胞衰老是细胞生理与生化反应发生变化的过程，主要表现是细胞对环境变化适应能力和维持细胞内环境恒定能力的降低，导致细胞形态结构和功能上发生一系列的变化。对多细胞生物而言，细胞衰老与机体的衰老是两个不同的概念，机体衰老并不等于所有细胞的衰老，但是细胞的衰老又是同机体的衰老紧密相关的。
问答题：
1．细胞衰老的特征有哪些？
衰老细胞形态结构和化学成分的变化，主要来自对体外培养细胞衰老的研究和对体内衰老细胞的形态观察。衰老细胞的特征概括起来可分为两大类：
第一， 形态结构方面的变化。细胞在衰老的过程中，其结构会发生深刻的变化，可概括如
下：①细胞核的变化。细胞核结构的衰老变化中最明显的是核膜的内折。另一个重要变化是染色质固缩化，这种染色质固缩作用与染色质蛋白的二硫键有关。②内质网的变化。在年老的动物细胞中，内质网已丧失正常有序的排列，弥散性分散于细胞质中，甚至趋于解体。糙面内质网的含量也随年龄的增长而减少。③线粒体的变化。细胞中线粒体的数量随年龄增大而减少，而其体积则随年龄增大而增大，膨大的线粒体中有时可见清晰的嵴，偶尔也会观察到线粒体内容物呈现网状化并形成多囊体，以及外膜破裂，多囊体释出的情况。在培养的人成纤维细胞中，还观察到两种不同类型的线粒体：一种是固缩紧密，一种是大而稀疏，通常每个细胞只含其中的一种类型的线粒体。随着倍增次数的增加，固缩紧密型线粒体越来越多。④致密体的生成。致密体有很多不同的名称如脂褐质、老年色素、血褐质和残体等，他们是由溶酶体或线粒体转化而来的。脂褐质可产生自发荧光，它是由自由基诱发的脂
质过氧化作用的产物。致密体是衰老细胞中常见的一种结构，绝大多数动物细胞在衰老时都会有致密体积累。⑤膜系统变化。衰老或有缺陷的膜通常处于凝胶相或固相，这时磷脂的脂肪酸尾被冻结了，完全不能自由移动，膜就由柔韧的液晶态变为刚性的固态，因此埋藏于其中的蛋白质也就不能在运动了，在机械刺激或在压迫等条件下，膜会出现裂隙，其选择透性及其功能均受到损伤。此外，细胞衰老时，细胞间隙连接及膜内颗粒的分布也发生变化，间隙连接明显减少，组成间隙连接的膜内颗粒聚集体变小，细胞间代谢协作也因此减弱。
第二， 代谢功能的变化。实验表明，细胞的代谢作用一般都随增龄而下降，其中最明显的
是蛋白质合成速率降低，其原因可能与核糖体的功能下降及蛋白质合成有关成分如肽链延伸因子数量减少有关。另一方面，衰老的细胞往往出现一些特异蛋白质，乳纤粘连蛋白通常是细胞外基质的主要蛋白质，但在衰老细胞中这种蛋白质大量合成，其可能与细胞的纤维形成有关。此外，衰老的细胞中胶原酶蛋白也过量合成。
2．细胞凋亡与细胞坏死的区别有哪些？
细胞凋亡的最终结局虽然也使细胞死亡，但与细胞坏死有显著的差异，与细胞坏死的区别是：①染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；②凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内溶物释放，故不会引起炎症；③线粒体无变化，溶酶体活性不增加；④内切酶活化，DNA有降解，凝胶电泳图谱呈梯状；⑤凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。 列表表示： 细胞凋亡与坏死细胞的比较 细胞凋亡细胞坏死 病理性诱导刺激生理或病理性 质膜完全丧失完整性和电化学梯度、胞浆内容物形态特征膜出芽，芽内含细胞器，膜结构外泄、膜起泡，泡内部含细胞器、膜完整性快速 改变，膜完整性逐步丧失、染色丧失，染色质呈絮状 质在核膜下半月状聚集，细胞缩细胞肿胀、溶解，无凋亡小体形成，周围组织炎小、凋亡小提醒成、细胞器完整、 症反应周围组织正常
生化特征能量依赖、4℃不会出现，含高度非能量依赖、4 ℃亦可发生，离子分布稳态失衡
受控的激活或酶解过程DNA断裂 DNA随机断裂，发生较迟（溶解后断裂）溶酶体发生较早，非随机断裂成酶的作用，不需蛋白质合成，不需基因调节
50/300kb，接着断裂成180bp或其
整数倍片断，核酸内切酶的作用，
有时需大分子（蛋白质）的合成，
有时需基因调节，有时不需基因调节 生理意义单个细胞死亡、巨噬细胞或邻细细胞群体死亡、巨噬细胞吞噬、明显的炎症反应 胞吞噬、无炎症反应
3．细胞凋亡的检测方法 形态学观测染色法、透射和扫描电镜观察 应用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征，有些染料如台盼蓝(trypan blue)为活细胞排斥，但可使死细胞着色。DAPI是常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助DAPI染色，可以观察到细胞核的形态变化。Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体的形成等形态。此外，使用透视和扫描电镜则可观察凋亡细胞核的形态、结构变化如染
色质因缩、凋亡小体的形成、细胞发泡等现象。
有时也有用两种染料进行复染，以便更可靠地确定细胞凋亡的变化。例如用吖啶橙(AO)和溴乙锭(EB)进行复染，AO只进入活细胞，正常的细胞核及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只能进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期细胞的核染成橙红色。 DNA电泳：
细胞发生凋亡时，DNA发生特征性的核小体间的断裂，产生大小不同的片段，但都是180-200bp的整数倍。凋亡细胞中提取的DNA在进行常规的琼脂糖凝胶电泳，并用溴乙锭进行染色时，这些大小不同的DNA片段就呈现出梯状条带。绝大多数凋亡细胞中DNA的断裂都表现出这种特征 .
TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法
TUNEL测定法(是terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) – mediated dUTP nickend labeling的缩写)，又与凋亡细胞DNA为核酸酶降解产生3’-OH的缺口和末端，故可用原位缺口平移法或原位末端标记法显示凋亡的细胞。这一方法能对DNA分子中3’-OH断裂缺口进行原位标记。凋亡细胞的核DNA中产生的3’-OH末端，可借助一种可观测的标记物，如荧光素进行原位标记，并用荧光显微镜进行观察。原位标记法的最大优点就是能在组织切片上识别难于辨认的凋亡细胞，不足之处为缺乏专一性，但可结合形态学予以正确判断。
彗星电泳法（comet assay）
彗星电泳法(comet assay)的原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案；而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，这是一种快速简便的凋亡检测法。 流式细胞分析
最常用来分析细胞凋亡的流式细胞技术是根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙锭使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。
4．细胞凋亡的生物学功能是什么？
细胞凋亡的现象从低等生物到高等生物都广泛存在着，在进化过程中形成的这一细胞死亡的方式大致有以下5个方面的生物学功能。（1）清除没有用的细胞，这类细胞大多在发育的早期阶段死亡，原因可能有以下几个方面：第一，在形态形成的过程中，一些进化遗迹随发育的进行不再有用而消亡，如鸡趾发育过程中广泛的细胞死亡有利于鸡趾的分开；第二，在进化过程中成对的结构，在发育时往往是其中之一随机死亡，以便更鲜明地突出另一结构的特点；第三，两性分化时发生细胞凋亡，如哺乳类和鸟类，发育早期苗氏管在两性都存在，以后在雌性个体他发育成子宫或输卵管，而在雄性个体中则死亡或退化。（2）清除多余细胞，在发育过程中某些细胞产生过多，则多余的细胞死亡，如小鸡背根运动神经元发育到一定阶段，有一半的细胞死亡；人脑神经元在发育过程中有约95%的细胞死亡。（3）清除那些发育不正常的细胞，最典型的例子就是脊椎动物视觉系统的发育，那些没有形成正确神经元连接的神经元被选择性地清除掉。大鼠视丘突起有精确的空间结构，视神经的神经轴突若与之有错误的联系，则很容易被识别，以后相继死亡。（4）清除已完成任务的细胞，一些细胞在发育过程中的功能很暂短，之后很快死亡，如变态时，可都变成蛙，其尾部有大量的细胞死亡，哺乳动物子宫内膜上皮细胞，在增生期很少细胞死亡，而在月经期则大多数上皮细胞死亡有利于开始新的生殖周期。（5）清除那些有害的细胞，细胞凋亡能清除那些对机体有害的细胞。如带有T细胞受体的胸腺细胞能识别并供给自身组织，如果这些细胞发育成熟会严重损害机体，所以这些细胞须在离开胸腺之前就被诱导死亡。
5．程序性死亡的基本过程。
（1）程序性细胞死亡的引发和执行。
在自然状态下，动物体内细胞即存在着分裂、存活过程，也存在着死亡过程，也就是说细胞内存在着活和凋亡两条反应体系，这些过程要受到体内其他细胞发出的信号和调节。细胞存活时需要有其他细胞提供的存活因子，如生长因子。如果去掉生长因子的供应，细胞凋亡反应体系即被激活，细胞死亡。
另外，细胞发出的信号，有的可能引起细胞发生程序性死亡，这种信号称为刺杀信号或死亡配体。细胞表面上有转移的传感器，可同死亡配体专一性结合，这种传感器即为细胞表面特一性受体，特称为死亡受体。死亡受体的细胞质区近C端处存在着一个由约80个氨基酸组成的序列，此序列成为死亡域。当死亡受体与死亡配体结合后，死亡受体被激活，死亡域将信号传至细胞内部，启动了细胞的程序性死亡反应体系。如，蝌蚪变态时甲状腺因其尾部退化，即属于这种情形。现已发现有多种因素可引起细胞发生程序性死亡（如电离辐射、刺激因素、糖皮质素等）。 （2）细胞凋亡的主要特征。
细胞死亡程序启动后，细胞内发生了一系列结构变化，如细胞质凝缩、细胞萎缩、细胞骨架解体、核纤层分解和核膜破裂等。除了这些形态特征外，在进行DNA电泳分析时发现，核DNA分解成片段，出现梯形电泳图。大量实验表明，核DNA断裂成片段，是细胞凋亡的主要特征之一。
凋亡细胞通过出芽方式分解成一些小泡，此即凋亡小体。凋亡细胞的质膜性质发生改变，如表面糖基发生改变，可被巨噬细胞表面的凝集素所识别，有时通常位于质膜内脂层的磷脂酰丝氨酸反转到了外脂层，巨噬细胞对暴露的磷脂酰丝氨酸具有识别能力，最后，凋亡小体被邻近的细胞或巨嗜细胞吞噬而被清除。由于没有胞内物质的释放，所以细胞凋亡并不引起炎症危及相邻的细胞。由此可见，程序性细胞死亡过程分为四个阶段：引发、执行、吞噬和清除。
6．程序性细胞死亡的信号传递系统如何？
死亡信号激活了细胞表面的死亡受体之后，即激活了细胞内与程序性死亡有关的蛋白酶级联系统，从而将细胞外信号转变成了细胞内信号传递。细胞内信号传递涉及到一个蛋白酶家族，这些酶以酶原的形式存在，受到信号作用后，通过自我切割而被缉获。激活的自杀性蛋白酶又可激活家族的其他的成员，引起蛋白质级联反应，导致反应得以放大。最后，被激活的蛋白酶切割了细胞中的具有关键性作用的蛋白质，从而快速利落地引起细胞死亡，如，由一种蛋白酶可水解核纤层蛋白，结果是核纤层不可逆地解体。
一个细胞可同时受到两种作用相反的信号刺激，有的促使细胞分裂，有的驱动细胞凋亡。存活信号对细胞的凋亡反应机制有钳制作用，哺乳动物中还进化出了另一种机制，机体可主动指导个体细胞自我破坏，这类指导性的细胞程序性死亡方式在免疫系统中特别重要。
死亡受体为跨膜整合蛋白，属于肿瘤坏死因子受体基因产物超家族，其细胞外区域含有丰富的半胱氨酸，细胞质区也含有一个类似的区域，为死亡域。死亡域可使死亡受体启动细胞进入细胞凋亡途径。某些从死亡受体传递信号的分子，本身也含有死亡域。所谓死亡域，即是指具有传递细胞死亡信号的肽链结构序列。
质膜上的整联蛋白可能参与了程序性死亡过程。整联蛋白与配体相互作用影响着细胞的粘着、迁移、生长和分化。整联蛋白可识别配体肽链中RGD结构域，含有RGD结构域的肽链可直接诱发程序性细胞死亡。实验发现，将含有RGD结构域的肽链导入细胞，可直接引起caspase 3 酶原自我加工而激活。caspase 3酶原是一种促程序性细胞死亡蛋白，被激活后启动细胞死亡程序。
7．在细胞凋亡过程中，caspase 具有哪些作用？
第十三章细胞的衰老与凋亡复习题
