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它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。
后来Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings方程）：
H＝2λdp＋＋\\s\%up 5(2p＋\\s\%up 5(2p＋\\s\%up 5(2f
2．影响柱效的因素
1）涡流扩散（eddy diffusion）。由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A＝2λdp，dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ越小。总的说来，应采用细而均匀的载体，这样有助于提高柱效。毛细管无填料，A＝0。
2）分子扩散（molecular diffusion）。又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u＝2γDm/u。u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm很小，通常仅为气相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向
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扩散，而引入的柱参数，用以对Dm进行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛细管柱的γ＝1。
3）传质阻抗（mass transfer resistance）。由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。
①流动相传质阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相前移，因而产生峰展宽。
②静态流动相传质阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。
Hm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p 成正比，与扩散系数Dm成反比。因此应采用低粒度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。
③固定相传质阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df的平
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方成正比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。
从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时间要短。②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。④适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03~0.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。⑤较小的检测器死体积。
3．柱外效应
速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即：
σ2＝σ2柱内＋σ2柱外＋σ2其它
柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应＜VR/。其次，希望将样品直接进在柱头的中心部位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。此外，要求进样体积≤VR/2。
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柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k＜2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显；k大的组分影响不显著。由于HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。而在经典LC中则影响相对较小。
III．HPLC系统
HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。
最早的液相色谱仪由粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从单一品种发展至几百种类型，检测器从单波长至可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪，逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。
目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。
一、输液泵 1．泵的构造和性能
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输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300 kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。恒压泵受柱阻影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵已被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。
柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响；泵压可达400 kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为0.1%左右，串联泵为0.2~0.3%），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。
各品牌输液泵的基本参数：
Waters 515型 HP 1100型 LC-10ATvp型 0.001~9.999 0.001 0.3% Elite P200 II型 检定要求 项目 流速范围 0.001~10 0.001~10 0.01~4.99 调节精度 流量精密度 标准文档
0.001 0.001 0.01 0.5% 1.5% RSD 0.1% 0.15%
HPLC原理和操作详解
