杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com λ噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒
目录号：DN22 目录编号 DN2201 DN2202
包装单位 50次 100次
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适用范围：
适用于快速λ噬菌体DNA ?
试剂盒组成、储存、稳定性：
保存 -20℃ -20℃ 室温 室温 室温 室温 室温 室温 室温 室温
试剂盒组成 RNase A DNase I 噬菌体沉淀液 裂解缓冲液 杂质沉淀液 结合液LB 漂洗液WB 洗脱缓冲液EB 吸附柱AC 收集管（2ml）
50次 20 mg 50 mg 100 ml 30 ml 5 ml 20 ml
100次 20 mg X 2 50 mg X 2 100ml X 2 60 ml 10 ml 40 ml
15 ml 25 ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇 10 ml 50个 50个
15 ml 100个 100个
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
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储存事项: 1.
在RNase A管和DNase I管分别加入1毫升的裂解缓冲液吹打，颠倒混匀，充分溶解RNase A和DNase I后， 按照每次使用量分装－20℃冻存，有效期6个月。 2.
结合液LB低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。 3.
避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 ?
产品介绍：
λ噬菌体载体广泛用于文库筛选，目的克隆培养获得大量的噬菌体颗粒需要提取λ噬菌体DNA来开展测序等后续工作。λ噬菌体裂解培养物离心后的上清，首先用RNase A /DNase I混合酶消化去除残留的宿主菌DNA/RNA，沉淀收集噬菌体，噬菌体被SDS裂解，残留碎片通过沉淀离心去除掉。裂解物上清中的λ噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将λ噬菌体DNA从硅基质膜上洗脱。 ? 1. 2.
产品特点：
不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
节省时间，简捷，可用于液体培养裂解物和固体培养板的提取，单个样品操作一般可在1.5小时内完成。 3.
产量高，典型的产量10ml λ噬菌体裂解培养物上清可以提取约10μg λ噬菌体DNA。 4.
多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9。可以直接用来酶切和测序。
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注意事项
使用转速可以达到13,000rpm的冷冻离心机。 开始实验前将需要的水浴先预热到37℃备用。 需要自备氯仿，20％SDS。
结合液LB含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 ?
操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 以10 ml噬菌体感染细菌培养上清提取举例： 提示：
? 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! ? 将噬菌体沉淀液放在冰上预冷。 1.
将0.5%氯仿处理后的λ噬菌体感染的液体培养物10,000g（约12,000rpm） 4℃离心10分钟去除细胞碎片和残渣。
转速不能过高，时间不能过长，否则噬菌体可能和碎片一起沉淀，降低产量。 2.
取10ml上清，加入20μl RNase和20μl DNase充分混匀37℃温育30分钟。 每个噬菌体培养上清因生长和裂解情况不同而残留RNA/DNA量不等。RNase/DNase消化过头，可能减少产量；消化不完全，可能未消化的DNA/RNA和细胞碎片粘去部分噬菌体减低产量并/或者导致最后污染宿主菌DNA，因此应该根据实际情况适当调节用量和消化时间。 3.
加入2 ml 冰预冷的噬菌体沉淀液，轻柔充分混匀后置冰上冷却（培养板裂解物必须在冰上放置30分钟）。 4.
10,000g（12,000rpm）4℃离心10分钟，弃上清，干燥1分钟。沉淀下来的噬菌
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体外观为透亮或者稍白的沉淀。 5.
加入500μl裂解缓冲液，吹打重悬噬菌体，加入100μl 20％SDS，立即轻柔颠倒混匀4-6次后，70℃温育10分钟，然后置冰上冷却。 6.
加入100μl杂质沉淀液，立即轻柔颠倒混匀4-6次，最高速13,000g 4℃离心10分钟。 7. 8.
仔细将上清转入新的离心管，加入350μl结合液LB，轻柔涡旋混匀。
将上述混合物加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
吸附柱一次最多只可以容纳大约700μl混合物，因此需要分次把混合物上到吸附柱内，重复步骤8。 9.
加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃废液。
10. 可选步骤：重复步骤9一遍。
11. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免
漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓
冲液EB（洗脱缓冲液事先在 50℃水浴中预热）， 室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟。如果想得到较多量的DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于40μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。 13. DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
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问题与解决方法: 问题 评论与建议 * 试剂盒储存在非最佳条件-建议：收到试剂盒后总是存放在室温（15℃-20℃）。
* 缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下-建议：储存在室温（15℃-20℃），每次用完后立刻盖紧盖子，以免溶液蒸发，pH改变和污染。
* 漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议：第一次实验时，在漂洗液WB
低核酸产量 或者纯度不高
中加入指定量无水乙醇。
* 试剂和样品没有充分混匀-建议：加入每个试剂后都要充分混匀。 * 噬菌体上清滴度太低-建议：1.确认λ噬菌体已经完全裂解了宿主菌（加入0.5%的氯仿可以帮助完全裂解）；2.离心去除宿主菌碎片残渣时间不能超过10分钟，转速不超过10,000g，否则否则噬菌体也可能和碎片一起沉淀丢失；3.重新培养一次噬菌体感染细菌。 * DNase I/RNase消化不足或者过头-建议：消化过头，可能减少产量并导致最后污染宿主菌DNA；消化不完全，可能未消化的DNA，RNA和细胞碎片粘去部分噬菌体，因此可以适当调节用量。
宿主菌基因组
DNA残留过高
* DNase I/RNase失活或者反应条件不佳-建议：DNase I/RNase必须溶解在裂解缓冲液中，必须分装冻存。λ噬菌体必须用LM(含镁离子)培养，在其它培养肉汤中，DNase消化活性可能受到影响。
* 不适合的离心温度和离心力。-建议：10,000g（12,000rpm）4℃离心
加入噬菌体 沉淀剂后未见到 λ噬菌体沉淀
10分钟。
* 上清中含λ噬菌体太少-建议：离心前，样品置冰上冷却。参见前面滴度太低解决办法
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λ噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书
