兰州理工大学生命科学与工程学院2014届研究生发酵工程原理作业
目录
前言................................................................................................................................ 1 1菌株的分离鉴定......................................................................................................... 1
1.1菌株筛选........................................................................................................... 1 1.2 菌株鉴定.......................................................................................................... 2 2培养条件的优化......................................................................................................... 2
2.1培养组分对发酵产酶的影响........................................................................... 2
2.1.1碳源对菌株发酵产酶的影响................................................................. 2 2.1.2氮源对菌株打搅产酶的影响................................................................. 2 2.1.3金属盐对菌株打搅产酶的影响............................................................. 2 2.2 培养条件对发酵产酶的影响.......................................................................... 3
2.2.1 初始pH值对发酵产酶的影响............................................................. 3 2.2.2 培养温度对发酵产酶的影响................................................................ 3 2.2.3 诱导物的质量浓度对发酵产酶的影响................................................ 3
3 菌株纤维素酶系活性比较........................................................................................ 3
兰州理工大学生命科学与工程学院2014届研究生发酵工程原理作业
产纤维素酶菌株的分离鉴定及其培养条件优化
前言
纤维素酶是一类可以水解β-1，4葡萄糖苷键，使纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一个酶系的总称Ⅲ，包括内切葡萄糖苷酶(endoglucanase，EC 3．2．1．4)，又称羧甲基纤维素酶(CMCase)，作用于纤维素分子内部的非结晶区；外切葡萄糖苷酶(cellobiohydrolase，EC 3．2．1．91)，又称微晶纤维素酶(C，酶)，作用于纤维素线状分子末端。纤维素酶在酿造、饲料、食品加工、纺织、造纸和洗涤等行业具有广泛的应用，特别是近年来随着能源和环境问题的日益严峻，利用纤维素酶降解秸秆原料生产燃料乙醇等新能源，以及辅助秸秆还田等研究课题受到日益关注。
纤维素酶主要由真菌和细菌产生，目前研究集中于以木霉(Trichoderma)和曲霉属(Aspergillus)等真菌产生纤维素酶，然而这些菌株仍存在着产酶成本高、酶活性不稳定、作用pH值范围狭窄等问题。细菌来源的纤维素酶具有真菌所不具备的特性，如耐碱性、耐热性等，并且细菌易于培养且生长和产酶周期短，因此对于细菌的研究是整个纤维素微生物降解研究中非常重要的环节。本实验目的是分离鉴定一株产纤维素酶的细菌菌株并进行培养条件研究，以期为纤维素酶的研究提供新的种质资源。 1菌株的分离鉴定 1.1菌株筛选
（1）采集兰州市附近有机质丰富土壤，稀释后涂布筛选培养基：CMC 10g/L、酵母粉5 g/L、NaHC03 3g/L(单独灭菌)、MgS04·7H2 0.01g/L、FeS04·7H20 5mg、MnSO4 5mg、琼脂20g/L，pH9.0。
（2）在30℃培养72h后，用0.2％的刚果红染色并用lmol/L的NaCI溶液脱色20min后测定透明圈与菌落直径比。
（3）挑取直径比较大菌落接种复筛培养基(在初筛培养基基础上添力120g/L葡萄糖，pH7.0)发酵24h后测定酶活力。
1
兰州理工大学生命科学与工程学院2014届研究生发酵工程原理作业
1.2 菌株鉴定
（1）观察菌落形态，经简单染色、革兰氏染色和芽胞染色后镜检。菌株生理生化鉴定方法参照《工业微生物实验技术》，结果与《常见细菌系统鉴定手册》对照。
（2）菌株序列由上海美吉生物医药科技有限公司测定。细菌基因组抽提试剂盒提取菌株基因组，得到DNA进行电泳分析。PCR引物：16S-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16S-R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR程序设定：预变性95℃5min；循环95℃30s，55℃30s，72℃90s，35个循环；延伸lOmin。
（3）电泳检测，切胶测序。将获得序列提交NCBI，通过BLAST进行同源性比较，构建系统发育树。 2培养条件的优化
2.1培养组分对发酵产酶的影响 2.1.1碳源对菌株发酵产酶的影响
碳源（20g/L）：葡萄糖、麦芽糖、果糖、糊精、淀粉和甘油，配制发酵培养基g/L)：碳源20、CMC 3、蛋白胨10、酵母粉5、K2HP04 2、NaH2P04 2、MgS04· 7H2O。
活化菌种按体积分数4％的接种量接入不同发酵培养基(pH7.0)中，30℃、200r/min摇床培养24h后测定酶活力。（以下操作同上） 2.1.2氮源对菌株打搅产酶的影响
氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素、大豆蛋白胨、硫酸亚铁铵，配制发酵培养基（g/L）：最佳碳源20、CMC 3、氮源10、酵母粉5、K2HP04 2、NaH2P04 2、MgS04·7H2O。 2.1.3金属盐对菌株打搅产酶的影响
金属盐：ZnSO4、NaCl、MnSO4、K2HSO4、FeSO4、MgS04·7H2O、CuSO4、CaCl2，配制发酵培养基（g/L）：最佳碳源20、CMC 3、最佳氮源10、酵母粉5、K2HP04 2、NaH2P04 2、金属盐1。
2
兰州理工大学生命科学与工程学院2014届研究生发酵工程原理作业
确定对菌株产酶有较大影响的碳源、氮源和金属离子，用于后续发酵工艺的优化。
2.2 培养条件对发酵产酶的影响 2.2.1 初始pH值对发酵产酶的影响
pH：6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，采用以上确定的最佳培养基。 2.2.2 培养温度对发酵产酶的影响
培养温度（℃）：25、28、30、32、37，采用以上确定的最佳培养基和pH。 2.2.3 诱导物的质量浓度对发酵产酶的影响
CMC质量浓度（g/L）：0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00，采用以上确定的最佳培养基，pH和温度。 3 菌株纤维素酶系活性比较
将纤维素降解为葡萄糖是3种纤维素酶（羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和微晶纤维素酶）协同作用的结果，因此保证纤维素酶系均衡是纤维素的降解利用的重要因素。
采用以上优化的最佳培养基和最佳培养条件，筛选的菌株发酵24h后测定酶活力，进行纤维素酶系活性比较，采用3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）。
参考文献：
[1]黄玉兰,李征,刘晓宁等.一株耐低温纤维素酶高产菌株的筛选、鉴定和产酶的初步试验[J].微生物学通报,2010,37(5):637-644．
[2]涂宗财,江国忠,刘益东等.枯草芽孢杆菌BS-05产纤维素酶条件的研究[J]．食品工业科技,2010,3l(5):1.
[3]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,200l:1-398.
[4]吕雄,赵晶,夏黎明.碳源对里氏木霉纤维素酶诱导合成的影响[J].食品与发酵工业2010,36(3):1-4.
[5]付建红,任晓源,范秋霜等.从天山花楸中分离筛选纤维素酶产生菌及其酶学性质研究[J].食品科学,2012,33(23):228-231.
3
产纤维素酶菌株的分离鉴定及其培养条件优化-2015.6.26
