NOD小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性

NOD小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性

舒冠男1,2,3，滕夏虹4，许倩倩1,2,3，邹春林1,2*

【摘 要】【摘要】 目的 建立分离纯化非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰岛的方法，并对其体内外生物学特性进行研究。方法 采用改良的胶原酶消化结合Ficoll密度梯度离心方法，分离纯化NOD小鼠胰岛。应用体外糖刺激实验检测分离纯化的胰岛功能，以及通过监测移植小鼠的血糖、体重变化及糖耐量实验对移植胰岛的体内生物学功能进行分析，并通过HE染色和免疫荧光染色检测肾被膜下移植胰岛的存活情况。结果 胰岛产率为(116±12)个胰岛/胰腺，纯度>90%。体外糖刺激实验结果显示，NOD小鼠胰岛的糖刺激胰岛素释放水平明显低于KM小鼠胰岛。胰岛移植实验显示，移植胰岛能有效改善糖尿病小鼠的血糖、体重和糖耐量，但改善作用一般仅能维持2周左右。HE染色和免疫荧光染色结果显示，肾被膜下可见胰岛素阳性的胰岛细胞团，并且在残存的移植胰岛细胞团周围存在大量淋巴细胞浸润。结论 通过改良的小鼠胰岛分离方法可由NOD小鼠分离得到大量较高纯度的胰岛，可用于今后探索如何阻断自身免疫损伤保护移植胰岛的研究。 【期刊名称】中国实验动物学报 【年(卷),期】2018(026)001 【总页数】7

【关键词】【关键词】 非肥胖性糖尿病；胰岛；分离纯化；移植；小鼠 研究报告

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

1型糖尿病是一类自身免疫性疾病，胰岛β细胞由于受到自身免疫系统的攻击，导致胰岛β细胞的破坏，胰岛素的绝对缺乏，产生一系列的代谢障碍和血糖升高。目前常用的1型糖尿病动物模型是链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的1型糖尿病啮齿类动物模型[1]， 但这种模型是利用STZ对胰岛β细胞的选择性毒性杀伤作用，诱使动物产生糖尿病，这种化学诱导法虽然简单易操作，但与临床上1型糖尿病病人的发病原因并不相同。非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)是通过选择繁殖和近亲交配从Jcl:ICR小鼠中获得的一种1型糖尿病小鼠模型，该小鼠模型通常于4～5周龄开始出现胰岛炎，进而破坏胰岛β细胞，于12～14周龄时出现明显糖尿病症状，到30周龄时雌性小鼠累计发病率可达到60%～80%，而雄性小鼠则不到20%～30%[2]。其与1型糖尿病患者一样，都是由于自身免疫系统的攻击导致胰岛细胞的损坏，最终导致代谢紊乱和血糖升高。因此，在1型糖尿病的研究中，具备较高的研究与实用价值。目前国内有关NOD小鼠胰岛分离与纯化方法的研究报导较少[3]，未见有对分离的NOD小鼠胰岛生物学功能的详细研究报道。本文旨在建立一种稳定高效的NOD小鼠胰岛分离方法，并对其体内外的生物学功能进行研究。旨在为今后利用NOD小鼠进行胰岛移植实验提供有价值的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 1.1.1 实验动物

7～8周龄雌性SPF级NOD小鼠23只， 体重18～20 g；13周龄雌性SPF级NOD小鼠30只，体重 22～25 g，均由北京华阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】，并已通过相关检疫，饲养于广西医科大学实验动物

中心【SYXK桂2014-0003】，SPF级封闭环境下，温度： 22～24℃, 湿度：45%～80%, 光照：150～300 Lx, 12 h昼夜交替。动物实验方案已通过广西医科大学实验动物管理与伦理委员会审查批准(批准号：201702007)。 1.1.2 主要试剂

胶原酶(货号：C9263)、Ficoll PM 400(货号：F4375)和双硫腙 (dithizone, DTZ)(货号：D5130) 均购自Sigma公司。小鼠Insulin ELISA试剂盒(货号：10-1247-01)购自Mercodia公司。25 μL气相微量进样针购自Hamilton公司。RPMI-1640(货号：11875-093)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(货号：10099-141) 购自Thermo Fisher Scientific公司。 1.2 实验方法 1.2.1 实验分组

同基因胰岛移植胰岛供体小鼠：7～8周龄血糖正常的雌性NOD小鼠。同基因胰岛移植受体小鼠：13周龄的雌性NOD小鼠每周监测两次血糖，连续两次血糖均>16.7 mmol/L即定义为发病小鼠，30只小鼠中共有12只发病，将发病小鼠随机分为两组，每组6只，一组移植组，一组为假手术组。 1.2.2 小鼠胰岛细胞团的分离纯化

10%水合氯醛腹腔注射麻醉胰岛供体NOD小鼠，动脉夹夹闭胆总管近胆囊端。小号头皮针(0.45 mm×0.16 mm)于胆总管内插管逆行注射预冷的胶原酶2～2.5 mL。分离胰腺，转移至50 mL离心管，每只胰腺再加入2 mL胶原酶溶液，于37℃水浴锅中消化18 min。消化完毕加入预冷的RPMI 1640溶液至50 mL终止消化，手摇1 min，然后通过孔径为500 μm的不锈钢滤网过滤，离心去上清(800 r/min，2 min)，并再次洗涤两次(800 r/min, 2 min)。完全去