图片简介:
本技术介绍了一种人用流感疫苗的生产方法及设备，具体方法包括利用多级生物反应器微载体悬浮培养对MDCK细胞进行多次扩增，当MDCK细胞扩增到所需数量时接种人流感病毒，最后获得病毒液并进行病毒液的过滤浓缩、灭活、裂解和纯化操作，得人用流感疫苗。在所述多级生物反应器中，当上一级生物反应器中的细胞悬液转移到下一级生物反应器中后，再向上一级生物反应器中加入下一批次细胞悬液，从而使每级生物反应器不间断生产。本技术所述一种人用流感疫苗的生产方法及设备，可以实现人用流感疫苗的可控化和连续性生产，生产周期短，适合大规模工业化生产。
技术要求
1.一种人用流感疫苗的生产方法及设备，特征在于：包括以下步骤：
（1）MDCK细胞在多级生物反应器微载体上扩增：
取生长良好的MDCK细胞，胰酶溶液消化，加入细胞培养液终止消化后转移至一级生物反应器（F）微载体上，补充细胞培养液使一级生物反应器（F）中细胞密度为1-
5×105cells/mL，开始搅拌；MDCK细胞在一级生物反应器（F）微载体上扩增培养完成
后，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液，加入胰酶溶液至完全淹没微载体，待细胞完全从微载体上消化脱落后，立即加入2-4倍胰酶溶液体积的细胞培养液终止消化，然后将细胞悬液输送至一个以上的次级生物反应器微载体上继续扩增培养；在不包含最后级的每一个次级生物反应器上的操作步骤为：从上一级生物反应器接收细胞悬液后，补充细胞培养液使MDCK细胞密度为1-5×105cells/mL后开始扩增培养并开始搅拌，待细胞密度达到培养目标时，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液，加入胰酶溶液溶至完全淹没微载体，待细胞完全从微载体上消化脱落后，立即加入2-4倍胰酶溶液体积的细胞培养液终止消化，然后将细胞悬液输送至下一级生物反应器；
（2）人流感病毒的接种和繁殖：
当最后一级生物反应器从上一级反应器接收细胞悬液后，补充细胞培养液使MDCK细胞密度为1-5×105cells/mL后开始扩增培养并开始搅拌，待细胞密度达到培养目标时，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液后将人流感病毒加入最后一级生物反应器中进行吸附，吸附温度33-37℃，吸附时间
20-40min，吸附完成后加入与细胞培养液等体积的病毒培养液进行培养；
（3）多次收获病毒液：
（31）在最后一级生物反应器中，待90%以上MDCK细胞产生病变后，停止搅拌使微载体自然下沉，收集生物反应器内上清液，所述上清液即病毒液，收集完成后加入病毒培养液继续培养；
（32）培养18-30h后，停止搅拌使微载体自然下沉，收集生物反应器内病毒液，收集完成后加入病毒培养液继续培养；
（33）多次重复步骤（32），至微载体细胞脱落60%以上后终止；按照人用流感疫苗检测规程对获得的病毒液进行检测，检测指标中，病毒液的血凝滴度不低于1:160；
（4）将步骤（3）得到的病毒液进行过滤浓缩、灭活、裂解和纯化，得到流感疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：所述微载体
密度为每升培养体积对应微载体5-40g。
3.根据权利要求1所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：所述步骤
（2）所述的人流感病毒为WHO提供的甲型和乙型流感病毒株。
4.根据权利要求1所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：所述步骤
（1）和（2）中细胞培养液的配制方法为：新生牛血清体积分数比为2-5%、3%L-谷氨酰胺体积分数比为1%，非必需氨基酸体积分数比为1%，剩余为MEM培养液，将上述成分混合后用碳酸氢钠溶液调节pH至7.4-8.2；所述步骤（1）和（2）中MDCK细胞扩增培养时的条件设定为:培养温度36-38℃，溶氧量30%-50%，搅拌速度40-80rpm。
5.根据权利要求1所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：所述步骤
（2）和（3）中病毒培养液的配制方法为：3%L-谷氨酰胺体积分数比为1%、非必需氨基酸体积分数比为1%，TPCK胰蛋白酶浓度为1μg/mL，剩余为MEM培养液，将上述成分混合后用碳酸氢钠溶液调pH至7.4-8.2；所述步骤（2）和（3）中病毒接种和繁殖的条件设定为：培养温度33-35℃，溶氧量30%-50% ，转速40-80rpm。
6.根据权利要求1所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：在所述多级
生物反应器中，当上一级生物反应器中的细胞转移到下一级生物反应器后，再向上一级生物反应器中加入下一批次细胞悬液。
7.一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：包括一级生物反应器（F）和一个
以上的次级生物反应器、细胞培养液罐（A）、病毒培养液罐（B）、过滤系统（C）、废液罐（D）、收液罐（E）、气体泵（J）、PBS储存罐（K）和多个液体传输系统；所述一级生物反应器（F）和一个以上的次级生物反应器的上方进液口与PBS储存罐（K）、细胞培养液罐（A）和病毒培养液罐（B）的出液口通过液体传输系统相连；所述一级生物反应器（F）和一个以上的次级生物反应器的下方出液口与废液罐（D）的进液口通过液体传输系统相连；在不包括最后级的每一级生物反应器的下方出液口还与其次级生物反应器的侧壁上的进液口通过液体传输系统相连，最后级生物反应器的下方出液口还与收液罐（E）的上方进液口通过液体传输系统相连；所述收液罐（E）的下方出液口与过滤系统（C）的进液口通过液体传输系统相连；所述液体传输系统上设有控制阀和压力传输口，所述压力传输口可与气体泵（J）通过软管连接。
8.根据权利要求7所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：所述一级生
物反应器（F）和一个以上的次级生物反应器具有控温、灭菌、搅拌、细胞密度监测装置。
技术说明书
一种人用流感疫苗的生产方法及设备技术领域
本技术涉及生物制药领域，具体涉及一种人用流感疫苗的生产方法及设备。背景技术
流行性感冒是由流感病毒引起的一种发病率高、流行广泛、传播迅速的急性病毒性呼吸道传染病，至今仍无法完全加以控制。流行性感冒是人们日常生活中经常会遇到的疾病，大多数人在一生之中都至少得一次流感。当然大多数的流感危害性不大，但由于其传染源广泛且传播途径众多，流感仍是影响当代人类健康的主要杀手之一。导致流感发生的直接原因是感染流感病毒，所以预防病毒感染的最有效的方法是注射流感疫苗。流感的大范围爆发给人类带来沉重灾难，WHO认为降低流感危害的主要措施是注射流感疫苗。因此提高疫苗生产的自动化程度，缩短生产周期，降低生产成本，技术适合大规模工业化生产的流感疫苗制备具有非常重要的意义。
目前国内企业生产流感疫苗的主要方式仍是凭借传统的鸡胚制备流感疫苗，而这种传统的培养模式存在许多不足，其使用数量、操作人员数量、占地规模等存在诸多不利，鸡胚制备的疫苗中存在卵清蛋白，可能导致过敏反应，疫苗产品的质量也变得逐渐不能够满足人们对高质量疫苗的需要。
现代基因工程技术的发展，促进了细胞培养方式制药的快速进展，目前国外已经获得批准上市的MDCK细胞流感疫苗生产企业已有Solvay、Novartis、Med Immune3家企业，反应器规模50L-2500L范围，研究表明10L反应器中密度为106cells/mL细胞数量制备的疫苗产量相当于10000只鸡胚的产量。国内细胞生产流感疫苗目前还处于空白，因此采用细胞基质培养流感病毒应用于疫苗生产具有诸多优越性，疫苗质量得到极大提高。虽然一些公司的鸡胚源亚单位疫苗继续在生产，但已经开发出新型流感疫苗的制造平台。
MDCK细胞生产的疫苗比在鸡胚中生产的疫苗与人类有更高的同源性，细胞培养流感疫
苗已在欧洲、北美等国家地区应用近10年，证实是安全有效的。
微载体悬浮培养实际是一种贴壁的细胞培养技术和悬浮培养技术的结合，在生物反应器中使用细胞吸附于无害的微载体颗粒中，在搅拌的作用下使微载体保持悬浮状态。但目前国内细胞悬浮培养技术发展相对滞后，国内疫苗生产企业仅少数利用生物反应器悬浮培养生产疫苗，反应器的规模与国外相比也有很大的差距。技术内容
人用流感疫苗的生产方法及设备的制作技术
