PCR突变技术方法概览
1基于PCR 的体外诱变技术
定点突变的方法很多，而基于 PCR 的定点突变技术由于其突变效率高，操作简单，耗时短，成本低廉等优点而倍受瞩目。近十年来，基于 PCR 的定点突变技术获得了长足的发展，目前运用此技术已能实现各种类型的基因突变。
基因突变实验包括以下几个步骤:1目的基因全序列变异文库的构建;2利用高通量表达筛选载体从变异文库中筛选表达突变体;3表达突变体的鉴定和表达研究。
1.1 重叠延伸PCR（over-lap extension PCR OE-PCR）
这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用OE-PCR不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除及插入。
其基本原理如图（1）所示。首先设计两个 PCR 反应以产生两个含突变位点的 DNA 片段，随后将上述两个 PCR 产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次 PCR 产物进行纯化处理可显著提高突变效率。
OE-PCR 不足之处在于：○1一个突变需要两对引物，3次 PCR，并且需对中间产物进行纯化。相对而言步骤较烦琐，不经济； ○2由于 DNA 二级结构及互补链的竞争等因素的影响，有时两个中间产物难于有效地相互结合导致目的产物得率很低；○3当利用 Taq 聚合酶进行PCR 反应时，经常在 PCR 产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方面导致两个中间产物难于有效地相互结合，另一方面可能会插入基因中导致产生非预期的移码突变。
针对这些不足，后来许多学者对OE-PCR 进行了改进。1997年，Urben等提出一步重叠延伸 PCR 法（one-step overlap extension PCR），使得三个 PCR 反
应得以在一个试管里进行，并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。其原理是首先将待突变的 DNA 以相反的方向克隆到两个载体中，这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同（例如pUC18,19）。这样便得到两个模板。将这两个模板，两个突变引物及一个与载体互补的通用引物置于一个试管中进行一次 PCR 反应即可得到含突变的目的基因。1997年，Warrens等利用不对称 PCR 反应产生单链中间产物，消除了互补链的竞争性影响，显著提高了目的产物的得率。1990年,Horton等用T4DNA聚合酶处理中间产物，降低了移码突变的发生率。由于OE-PCR几乎没有任何特殊条件的限制，而且成功率很高，因此运用非常广泛。
1.2 大引物 PCR 法(megaprimer PCR)
OE-PCR虽然突变成功率很高，但一次突变需要两对引物，进行三个 PCR 反应，还需对中间产物进行纯化。因此，相对而言成本偏高，操作较烦琐。大引物 PCR 法是 OE-PCR 的改进版，利用大引物 PCR 法只需三个引物，两个 PCR 反应，而且无需中间产物纯化等步骤。其方法是先设置一个 PCR 反应产生一个含突变的 DNA 片段，然后再以此 DNA片段作为引物与原模板退火进行 PCR 扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的 DNA 片段较通常的引物要大许多通常有上百碱基，所以命名为大引物 PCR 法。最初采用的大引物 PCR 法突变效率较低，只有约 50%终产物符合预期的要求，因此后续的筛选鉴定工作量较大。后来许多学者通过对引物进行巧妙设计或对模板进行巧妙处理，从而使得大引物 PCR 法达到类似 OE-PCR 的突变效率。例如，有学者等对模板进行适当的酶切处理遏制了野生型模板的扩增，提高了突变效率。Te等在设计引物时使第一轮 PCR 的引物和第二轮 PCR的引物长度相差较大，相应它们的解链温度Tm值也产生显著差异.这样第一轮 PCR 采用低的退火温度,之后在无需纯化的情况下直接加入高 Tm值引物,同时相应提高退火温度,与大引物一起引发第二轮 PCR 扩增。基于这一设计,不仅排除低 Tm值的引物的干扰,使野生型模板不致被扩增,而且省略了大引物的纯化步骤,使整个反应能在一个反应管内进行。
1.3特殊位置碱基的定点突变
如上所述，进行一次突变一般需要经历 1 到 3次 PCR 及中间产物的纯化等步骤。但当需突变的碱基位于某些特殊位置时，就可以简单地运用一次PCR 实现定点突变，下面讨论这样两种特殊情况。
（1）需突变碱基位于基因的末端
当需突变碱基位于基因的末端时，定点突变便非常简单易行。只需设计一对引物，其中一个为突变引物，含有欲突变的碱基，另一个引物则完全与模板互补。此二引物在 5’端均含有适宜的限制性酶切位点及“夹子”序列，以便将扩增产物克隆入载体中，如图 2 所示。
（2）唯一限制性位点删除法(unique site elimination technique USE）
当需突变的碱基附近含唯一的限制性酶切位点时，如图 3 所示，可以设计一对引物，其中突变引物含有上述限制性酶切位点及欲突变的碱基。以野生型基因为模板进行 PCR 扩增。随后用限制性内切酶将野生型基因的待突变区切除，并将 PCR 扩增产物与野生型基因的残留片段连接，从而得到完整的含突变基因。但利用该方法必须注意：突变碱基附近必须含有一限制性酶切位点，并且这一位点在整个基因的其他位置不能有。实际运用中符合这一条件的情况不多见，因此这一方法受到很大限制；然而，一旦条件具备，运用这一方法，较其他方法都要省时省力。
1.4 扩增环状质粒全长的突变方法
前述几种方法都既适用于线性 DNA 也适用于环状 DNA，然而当待突变的基因已经克隆入环状质粒时，只能选择另一类方法进行突变，既：利用一对含突变的引物扩增整个环状质粒，从而得到含突变的线性 DNA，随后将线性 DNA 环化便得到完整的含突变的质粒。由于引物设计策略的不同，这一方法又可以分为两种：一种方法是一步PCR法（single step PCR , S-PCR），两个引物反向、紧邻但没有重叠区，利用高保真聚合酶扩增产物是平末端的线性 DNA，需用末端磷酸化和T4连接酶环化处理，从而获得具有定点突变的重组子。原理如图 4 所示。另一种方法，以 Stratagene 公司开发的定点突变试剂盒为代表，两个引物也是反向的并且其 5’端有 15个碱基以上的重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自行环化。其原理及步骤见图5。上述两种方法理论上说既简单又经济，应该成为首选。但事实上要扩增出完整的质粒并非易事，尤其是当质粒较大时，这对聚合酶的质量提出较高的要求，另外循环参数也需精确调节，而且模板质粒要求至少有80%以上是超螺旋的，带切口的质粒不能作为模板。
1.5 利用 OE-PCR 进行插入及删除突变
小片段的插入与删除完全可以按点突变的方法实现，而大片段的插入与删除用其他方法很难实现，但 OE-PCR 技术使之变得轻而易举。图 6 示意了利用
OE-PCR 进行删除突变的方法。
1.6非连续多核苷酸定点突变的方法
该方法建立了一种突变引物延伸单链与PCR技术相结合的方法,它能有效地对目的基因进行大区域非连续多核苷酸的定点突变改造。经碱变性后的质粒ＤＮＡ,先用突变引物延伸单链,然后通过PCR扩增得到突变双链DNA。与经典的含Ｕ单链寡核苷酸定点突变方法相比,本方法突变效率高,并省去了对突变克隆杂交筛选的操作。
该方法综合了质粒双链ＤＮＡ测序中的碱变性和寡核苷酸定点突变中的突变引物延伸,即突变引物与碱变性的单链模板先结合并延伸,产生含突变位点的单链,再通过ＰＣＲ扩增出双链。在突变引物中,由于突变位点是分散的,被突变位点间隔
的核苷酸能否与模板结合起到稳定突变引物，模板杂交体的作用尚不清楚。但从结果来看,当突变引物3′端一侧有9个碱基与模板完全配对,即能保证杂交体的足够稳定和延伸反应的正确性。延伸反应后,先高温变性,再缓慢降温,推测这有利于被碱变性解链的两条完全互补的单链重新退火结合,使反应体系中有较多的突变引物延伸的单链。在ＰＣＲ第一个循环中,省去加热变性步骤,通过3′端引物与反应体系中游离的单链结合和延伸,为后续循环反应的5′端(突变)引物提供单链模板;然后在严谨退火条件下,使5′端和3′端引物分别与各自完全配对的模板结合,从而得到与突变设计一致的双链片段。除了用环状质粒ＤＮＡ作为模板,本方法也适用于线性双链ＤＮＡ模板。
2 PCR 介导的随机突变
一般来说，只有当对某段序列的功能有确切了解，已知改变某个或某几个碱基可能会产生明显的效果时才采用定点突变法。然而在很多情况下，研究者对目的序列的了解是很有限的，这时为了研究目的序列的功能往往需要引入大量的随机突变，构建突变库，再逐个筛选和鉴定。随机突变常采用化学或自然诱变法，PCR 法并不常用，然而事实上PCR 法介导随机突变非常有效，特别是当随机突变需局限在一小段区域时。PCR 介导随机突变主要有两种策略，一种是利用简并引物，简并引物的特点是其5’端有十几个碱基是随机组合的。这一方法除引物特殊外，其余均与定点突变技术完全一样。利用简并引物可以产生大量随机突变，并且这些突变都集中在很窄的一段区域内。另一种方法即易错PCR 技术（error-prone PCR），其原理在于，忠实性较低的聚合酶如 Taq 在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变，这些措施包括提高 Mg2+浓度，改变 dNTP 的比例，调节热循环参数等。易错 PCR技术突变率较低，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错 PCR（Sequential error-prone PCR）策略，即将一次 PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板,连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
基于PCR技术的随机诱变方法构建的全基因序列变异文库分别重组进筛选载体pUC18-GFP中。外源基因从GFP基因的5′端重组进筛选载体、转化大肠杆菌,如果一个重组质粒可以表达外源蛋白与GFP的融合蛋白,含此重组质粒的转化菌落在紫外光下将会发出绿色的荧光。据此能够筛选到可在筛选载体中表达的外源基因。
3化学或物理方法诱发基因突变
3.1辐射
典型的物理诱变剂是不同种类的射线，常见的有X射线，r射线和中子，此外还有紫外线和β射线。X射线是种波长为1000－100埃的电离射线，是最早的诱变射线。r射线是一种波长更短的电离射线，其波长0.1－1埃，60CO和137CS是目前应用最广的r射线源。中子是不带电粒子，在加速器或核反应堆中得到能量范围极广的中子。252Cf自发裂变中子源可应用诱发突变。β射线是电子或正电子的射线束，由32P和35S等放射性同位素直接发生的。透过植物组织能力弱，但电离密度大。当同位素溶液进入组织和细胞后作为内照射而产生诱变作用。
X射线和r射线都是能量较高的电磁波，能引起物质的电离。当物体的某些较易受辐射敏感的部位受到射线的撞击时，而发生离子化，可以引起DNA链断裂，当修复时不能恢复到原状就会出现突变。如果射线击中染色体则可能导致断裂，在修复时可能造成缺失、重复、倒位和易位等染色体畸变。中子不带电，但当与生物体内的原子核撞击后，使原子核变换产生r射线等能量交换，从而影响DNA和染色体的改变。
3.2化学诱变剂
化学诱变剂种类很多，如工业污染中的煤烟和汽车废气中的苯并芘，工业试剂及工业原料中的乙烯亚胺、甲醛，食品工业中的亚硝酸盐，食品污染中的黄曲霉毒素等等，都可以引起突变。化学诱变剂诱变机理：
烷化剂：指具有烷化功能的化合物,带有一个或多个活性烷基,该烷基转移到一个电子密度较高的分子上,可置换碱基中的氧原子，碱基被烷化后，DNA在复制时会导致配对错误，产生突变。
叠氮化钠：一种动植物的呼吸抑制剂，可使复制中的DNA的碱基发生替换，从而导致突变体的发生，是目前诱变率高而安全的一种诱变剂。
化学诱变剂的处理方法：
利用化学诱变剂处理种子较为普遍，其方法是直接把种子浸泡在含有化学试剂的溶液中，可以诱发各类体细胞突变。一般来说，玉米种子的处理效果较差，因为成熟的玉米籽粒胚中具有分开的、已定型的雄花和雌穗原基细胞，并且在突变发生过程中容易产生细胞间的竞争，使突变细胞受到抑制或消亡，被排斥在生殖过程之外。
用含有化学药剂的石蜡油处理玉米花粉是目前已知的最有效的方法。以EMS为例，具体的处理方法步骤如下：用EMS与轻质石蜡油混合，制备成浓度为0.1-0.2%EMS处理液；在适当的时间，收集玉米新鲜花粉，在一个带盖的瓶中，把花粉与EMS处理液混合；最后用一把小号毛刷，把被处理花粉涂到选好的雌穗花丝上。
其他诱变因素 除辐射和化学诱变剂外，过高或过低的温度也可能引起突变。
4 PCR诱变法与其他诱变法的比较
基因诱变的方法很多，除了基于 PCR 各种诱变法外，常用的方法还有化学诱变、寡核苷酸介导的诱变和盒式诱变等。在此将各种诱变方法作一个简单的比较。
4.1 化学诱变
化学诱变法常用来介导大范围的随机突变，其优点在于突变范围广、效率高、成本低，操作也相对较简单。缺点在于突变范围不可控制，重复性差。另外，其最大的缺点在于所用的诱变试剂往往是剧毒或致癌剂，对研究人员及环境的危害较大。而易错PCR 技术虽然也能产生随机突变，但突变效率明显不如化学诱变。连续易错 PCR 技术对突变效率有所改善，但操作则显得比较繁复。但对突变效率要求不高的情况下，可以考虑用易错 PCR 技术来介导随机突变。
4.2 寡核苷酸介导的定点诱变
寡核苷酸介导的定点诱变术是一种很成熟且运用很广泛的方法。这种方法突变效率较高，突变位点能够精确控制，成本较 PCR 法低，因此为许多研究者所偏爱。其缺点在于操作过于繁复，耗时较长。早期采用掺“U”单链法，需要克隆 M13 噬菌体，制备掺“U”单链等步骤，非常烦琐。后来许多公司及研究者对这一方法进行了改进，使得操作简单了许多，但依然不如 PCR 法简便，快捷，特别是当目的基因为线性 DNA 时。以前认为寡核苷酸介导的定点诱变法较 PCR 法忠实性高，随机突变率低，而事实上随着高保真聚合酶的广泛运用，PCR 法在忠实性方面已毫不逊色。因此对这两种方法的选择，研究者见仁见智。但在对分布范围很广的多个核苷酸进行定点突变时，寡核苷酸介导的定点诱变法具有非凡的优越性，它可以一次性对多个位点同时诱变。而 PCR 法则只能逐个进行突变。
4.3 盒式诱变
盒式诱变的突出优点是操作非常简单，快捷—只需“一切，一连”两个步骤便大功告成。然而这种方法的运用受到极大限制，因为它需要在突变位点两侧具有唯一的限制性酶切位点，大多数情况下这一条件很难满足，因此这种方法不具有通用性。
参考文献：
【1】 基于PCR的体外诱变技术. 罗师平，冷希岗. 博士论文. 2000. 中国医学科学院
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