基因工程目的蛋白的制备

基因工程制备重组人白细胞介素-15

1.相关背景：

之前进行王旻老师布置的生物技术前沿进展文献综述中，我挑选了“CAR-T细胞疗法”进行论述，我在其中分析CAR-T细胞疗法的问题与挑战时，针对回输的CAR-T细胞的持久性进行文献查阅时发现有研究显示，IL-7联合IL-15能扩增出干细胞样的记忆性T细胞，能在体内更好存活，具有更强的抗肿瘤效应。于是，借此次作业之际，选择基因工程制备重组人白细胞介素-15这一题目，以期有更深入的认识。

人白介素-15由114氨基酸残基组成，分子量为12-18kD。主要由单核细胞和巨噬细胞产生。能刺激激活B细胞，诱导NK样细胞的分化，趋化T淋巴细胞。还可对免疫系统外的多种组织和细胞发挥广泛而多效的作用。由于白介素作用的广泛多样性，可在天然免疫和获得性免疫反应中产生交叉的调节作用，因而可将其看作天然免疫和获得性免疫系统间的桥梁。现已证明L-15可以促进淋巴细胞和NK细胞增殖并增强其生物活性，在体外还可以使外周血和脾脏的淋巴细胞转变为具有高杀瘤效应的LAK细胞，这些功能类似于IL-2，但不完全等同，L-15还有一些L-2所不具有的生物活性。

人IL-15位于第四号染色体q25-35区，长14968 bp，包括六个外显子和五个内含子。 人IL-15 mRNA包括一个含316 bp 5’非编码区，486bp开放阅读框架(ORF)以及400bp3’非编码区。 IL-15 cDNA含有单一ORF ,编码含162个氨基酸的多肤前体，其中包含一段48aa的前导序列，其N端部分被降解后形成分子量约13 KD的成熟IL-15 。研究表明，糖基化位点位于N79和N112，非糖基化的重组IL-15的活性比糖基化的IL-15要高2-3倍。因此，我选择原核表达系统。

从NCBI获得人IL-15的基因序列如下：

1 tgtccggcgccccccgggagggaactgggtggccgcaccctcccggctgcggtggctgtc 61 gccccccaccctgcagccaggactcgatggagaatccattccaatatatggccatgtggc 121tctttggagcaatgttccatcatgttccatgctgctgctgacgtcacatggagcacagaa 181 atcaatgttagcagatagccagcccatacaagatcgtattgtattgtaggaggcatcgtg 241gatggatggctgctggaaaccccttgccatagccagctcttcttcaatacttaaggattt 301 accgtggctttgagtaatgagaatttcgaaaccacatttgagaagtatttccatccagtg 361ctacttgtgtttacttctaaacagtcattttctaactgaagctggcattcatgtcttcat 421 tttgggctgtttcagtgcagggcttcctaaaacagaagccaactgggtgaatgtaataag 481tgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatac 541 ggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagtt 601 acaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgat 661 catcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaaga 721 atgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgt 781ccaaatgttcatcaacacttcttgattgcaattgattctttttaaagtgtttctgttatt 841 aacaaacatcactctgctgcttagacataacaaaacactcggcatttaaaatgtgctgtc 901 aaaacaagtttttctgtcaagaagatgatcagaccttggatcagatgaactcttagaaat 961 gaaggcagaaaaatgtcattgagtaatatagtgactatgaacttctctcagacttacttt 1021 actcatttttttaatttattattgaaattgtacatatttgtggaataatgtaaaatgttg

1081aataaaaatatgtacaagtgttgttttttaagttgcactgatattttacctcttattgca 1141 aaatagcatttgtttaagggtgatagtcaaattatgtattggtggggctgggtaccaatg

1201 ct

从NCBI中获得IL-15的氨基酸序列如下：

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGD ASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

2.制备目的：

通过设计IL-15的基因工程制备方法，融会贯通基因工程相关知识；在设计过程中查阅相关文献，进一步了解IL-15在增强CAR-T细胞持久性中的可能原因。

3.方法概述：

3.1 从外周血单核细胞中提取总RNA，反转录，通过PCR获得IL-15的基因。

3.2 构建四种非融合型表达质粒，在大肠杆菌里表达，比较它们的表达效率，筛选出最佳的高效表达工程菌株。同时构建一种融合型表达质粒，比较两者的制备工艺。 3.3 完成目的蛋白的鉴定和分离纯化，优化表达条件提高蛋白表达量。第一步是进行包涵体的处理以粗步纯化，第二步是采用离子交换层析纯化，第三步是采用凝胶过滤层析纯化。

4.实施方案：

4.1淋巴细胞的分离和激化：

抽取正常人静脉血，采用Ficoll-Hypaque分层液法分离外周血单个核细胞，并用conA激化淋巴细胞，后置于二氧化碳培养箱培养。

4.2总RNA的提取：

采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，需要用到TRIZOL、氯仿、异丙醇、乙醇等试剂。 4.3 cDNA的获取：

进行RT-PCR反应，以提取的总RNA中的mRNA为模板，用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

4.4 PCR扩增：

这里采用巢氏PCR来钓取IL-15的基因。以得到的cDNA为模板，用一对引物(primer 1 a和primer 1 b)进行预扩增。然后再以前面的PCR产物为模板，采用一对引物(primer2a和primer 2b)进行扩增，得到PCR产物，并检测其基因长度与需要的基因长度是否吻合。引物的设计主要通过从先关文献查取或者使Oligo、Primr premier等软件设计，引物的设计需要满足较为苛刻的条件，如引物长度一般在15-30个bp,并且要求尽量减少错配和引物二聚体的形成等等。本步骤用到的引物序列如下：

Primer 1a ： 5’-TAGCAGATAGCCAGCCC-3’ Primer 1b ： 5’-TGTTATGTCTAAGCAGCAGAG-3’

Primer 2a : 5’? TCTAGAGTAATGAGAATTTCGAAACC?3’

Primer 2b : 5’... AAGCTTGGATCCTAAGAAGTGTTGATGAACATTTG?3’ 4.5四种非融合型表达质粒的构建: 为了得到成熟的IL-15蛋白，这里采用了原核表达表达体系。选择原核系统进行表达的原因之前已经提及，据文献分析这样缺乏糖基化的蛋白反而活性更高。最为关键的是，采用原核表达体系，产率会非常高，而成本却极为低廉。本文构建四种非融合型表达质粒，其中两种是热诱导的质粒，另外两种是IPTG诱导的质粒。之所以这样，是为了找到一个尽可能

高效稳定表达的质粒，使它能达到生产的要求。尽可能降低成本，提高产率，是使它在工业上具备生产价值的两个基本目标。

这四个表达质粒分别是:PLI, BVI; ETI, DRI。其中前两种是热诱导的质粒，后两种为IPTG诱导的质粒。然后将会比较它们的表达效率，选择一个最佳的表达质粒。

下面分别叙述五种质粒的构建过程。 （1）质粒PLI的构建：

设计一对引物(primer 4a和primer 4b)，通过PCR扩增基因片断。胶回收后，采用EcoRl和Xho 1双酶切，再次胶回收。扩增质粒，同样采用EcoRl和Xho 1双酶切，胶回收。按比例混合载体和IL-15片断，用T4DNA连接酶连接。引物序列如下：

Primer 4a)：ATGCCGGAATTCATGAACTGGGTTAATGTAATAAGTG Primer 4b)：TTACCGCTCGAGGGATCCTTAAGAAGTGTTGATGAACATTTG （2）质粒BVI的构建： 方法与上述一致，用引物(primer 4a和primer 4b)，通过PCR扩增基因片断。采用EcoRl和BamH 1双酶切，扩增质粒，同样采用EcoRl和BamH 1双酶切，用T4DNA连接酶连接载体和IL-15片断。

（3）质粒 ETI 的构建：

同样使用一对引物，采用Nco 1和Xho 1双酶切。 （4）质粒 DRI 的构建：

同样使用一堆引物，采用 Eco R 1 和 Hind 3 双酶切 （5）一种融合型表达质粒RSETI的构建：

前面得到的四种质粒都是非融合表达的，这个质粒却融合了His 标志。目的是为了有利于纯化，因为可以利用镍柱亲和层析。大大简化了纯化步骤。而且也大大提高了表达量。构建过程主要参照已有文献，采用一对引物扩增质粒，用Xho 1和Hind 3的双酶切。

4.6CaCl2处理制备大肠埃希菌感受态细胞 4.7体外重组DNA转化感受态细胞 4.8蓝白斑筛选阳性克隆：

重组质粒中含有LacZ基因和氨苄青霉素抗性基因，进行双平板蓝白斑筛选，透亮菌落为阳性克隆。

4.9目的蛋白的诱导表达：

采用42 ℃热诱导PLI和BVI，而ETI和DRI采用IPTG诱导。 4.10 IL-15的分离纯化：

分别收集这四种质粒在诱导后一定时间的菌液，超声破碎细胞，然后进行包涵体粗提、离子交换、凝胶过滤和亲和层析纯化蛋白。

4.11 IL-15的鉴定：

采用兔抗人IL-15作为一抗的Western blot鉴定表达产物为IL-15，或者可以更进一步采用紫外扫描鉴定。

4.12不同载体表达效率比较：

BCA法测蛋白浓度，然后进行蛋白电泳，比较蛋白占总蛋白比例。 4.13 IL-15生物活性检测：

采用MTS法或者MTT法测定人IL-15对于CTLL2的增值活性的影响。

5.讨论：

构建过程中，需选择不同表达载体，以期筛选出较优的的表达方法，但是表达效果同时也与工程菌的选择以及培养条件等先关，需在实际试验中摸索。