瑞舒伐他汀对同型半胱氨酸诱导的小鼠血管平滑肌细胞去
分化和内质网应激的影响及其机制研究*
周昌钻1，2，潘孙雷1，林 辉1，孟立平1，季 政1，池菊芳1，郭航远1△ 【摘 要】【摘要】 目的：探讨瑞舒伐他汀（Rsv）对同型半胱氨酸（Hcy）诱导的小鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）去分化及内质网应激（ERS）的影响。方法：Hcy和不同浓度瑞舒伐他汀（0.1，1.0，10μmol／L）干预 VSMCs，48 h后检测细胞骨架及表型蛋白（α-SMA）、钙调节蛋白（calponin）和骨桥蛋白（OPN）变化，并检测 ERS相关 mRNA（Herpud1，XBP1s和 GRP78）在不同时间点的水平；再在Hcy及Rsv干预基础上给予ERS抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）或诱导剂衣霉素来调控细胞ERS水平，检测细胞增殖、迁移和表型蛋白表达，明确ERS在Rsv表型保护中的作用；在Hcy及Rsv干预基础上给予雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-P70S6激酶（P70S6K）信号抑制剂雷帕霉素或激活剂磷脂酸，检测 mTOR-P70S6K磷酸化和ERS水平，明确mTOR-P70S6通路在Rsv调控ERS中的作用。结果：与Hcy组相比，Hcy+中Rsv组（1μmol／L）和Hcy+高Rsv组（10μmol／L）细胞骨架极性明显增强，α-SMA、calponin表达升高，而OPN及ERS相关mRNA水平显著降低（P＜0.01）；与 Hcy组比较，Hcy+Rsv组和 Hcy+4-PBA组增殖、迁移水平降低（P＜0.01），收缩蛋白表达增强，但衣霉素干预则逆转了Rsv的上述作用；与Hcy组相比，Hcy+Rsv组和Hcy+雷帕霉素组的mTOR-P70S6K磷酸化及ERS水平降低（P＜0.01），但磷脂酸干预抑制了Rsv对mTOR-P70S6K通路和ERS的影响。结论：瑞舒伐他汀可能通过mTOR-P70S6K通路抑制ERS水平，抑制Hcy诱导的小鼠VSMCs去分化改变。
【期刊名称】中国应用生理学杂志 【年(卷),期】2018(034)001 【总页数】6
【关键词】【关键词】表型去分化；血管平滑肌；瑞舒伐他汀；内质网应激；同型半胱氨酸；小鼠
高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血症是动脉粥样硬化性冠心病的独立危险因素。但是，降Hcy治疗能否使患者在心脑血管疾病中获益在临床研究中仍未达成共识［1］。因此，Hcy在心血管疾病中可能具有更复杂的调控机制。研究发现，Hcy可诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）发生表型去分化［2］。
血管平滑肌表型的去分化与心脑血管病密切相关。平滑肌与其他肌细胞相比，具有很强的表型重塑性。成熟分化的VSMCs呈长梭形，稳定表达包括表型蛋白（smooth muscle actin-α，α-SMA），钙调节蛋白calponin和smoothelin在内的收缩相关蛋白，细胞增殖与迁移能力极低，称为收缩型VSMCs。但收缩型VSMCs在异常刺激下可发生表型去分化，一方面细胞收缩蛋白表达减少，分泌蛋白如骨桥蛋白（osteopontin，OPN）表达增强，细胞骨架极性分布减弱；另一方面细胞增殖、迁移能力增强［3］。VSMCs收缩表型的丧失是冠心病、肺动脉高压、主动脉瘤等心血管疾病的重要病理变化［3，4］。
现研究发现，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可能在心血管疾病发病中发挥重要作用。ERS是细胞内环境受到干扰后，未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔大量堆积，进而影响细胞功能的异常状态。高同型半
胱氨酸血症、高脂血症、血管机械损伤等危险因素都可引起血管壁细胞ERS状态。此外，在巨噬细胞、内皮细胞及脂肪细胞中也都观察到ERS发挥着表型调控的作用［4］。但是ERS是否参与调控Hcy诱导的VSMCs去分化，仍未被人们了解。
临床中血管保护药物，如他汀类药物被发现存在药物作用的多效性［5，6］。但是，这类常用药物多效性是否与血管ERS状态相关，仍不十分明确。本研究旨在明确瑞舒伐他汀（rosuvastatin，Rsv）对 Hcy诱导的VSMCs表型去分化的影响并探讨ERS在其中的作用，进一步揭示ERS在他汀类药物的血管保护作用的机制，为血管重构性疾病的治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SPF级C57BL／6小鼠，雌雄不限，8周左右，体重22～25 g（购自上海斯莱克实验动物有限责任公司）。实验试剂：Hcy、血小板源生长因子-BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）衣霉素、磷脂酸（sigma），Rsy（Medchem Express），4-苯基丁酸（杭州昊鑫生物有限公司），Ⅱ型胶原酶（Vetec），荧光染料 488Ⅰ-鬼笔环肽（Abnova），real-time PCR试剂盒（Roche），DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO），α-SMA、OPN、calponin、GAPDH单克隆抗体（Abcam），雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、phospho-mTOR（S2448）、P70S6激酶（P70S6 kinase，P70S6K）、phospho-P70S6K（T389）单克隆抗体（Cell Signaling Technology），辣根过氧化酶标记二抗（Abbkine），MTT（Emresco），Transwell小室（Corning）。
瑞舒伐他汀对同型半胱氨酸诱导的小鼠血管平滑肌细胞去分化和内质
