慢病毒介导的CAV1过表达对HL-60细胞增殖与凋亡的影
响
马微1,2,王迪迪1, 王昭1, 朱贵明1, 张鹏霞1*
【摘 要】摘要 本研究旨在探讨慢病毒介导的CAV1过表达对HL-60细胞增殖与凋亡的影响。构建慢病毒重组表达载体pcDNA-EF1-CAV1,并与pPACK包装质粒混合物共转染至293TN细胞后，收集病毒液感染HL-60细胞，使CAV1基因在细胞中稳定转染并高表达。采用Western blot方法评价转染后HL-60 CAV1蛋白表达情况。采用CCK-8法、流式细胞术分别检测转染前后HL-60细胞的增殖活性和凋亡情况。结果表明：PCR阳性克隆筛选及核苷酸测序结果证实CAV1基因正确插入表达载体pcDNA-EF1-GFP中。重组慢病毒颗粒Lv-CAV1成功转染HL-60细胞,转染率达90%。Western blot检测结果显示，转染后48 h HL-60细胞中CAV1蛋白表达明显增高。CCK-8检测结果显示转染后48 h HL-60细胞增殖活性降低(P<0.05)，流式细胞仪检测结果显示转染后HL-60细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。 结论： CAV1过表达对HL-60细胞具有抑制细胞的增殖活性、促进细胞凋亡的作用。 【期刊名称】中国实验血液学杂志 【年(卷),期】2013(021)004 【总页数】6
【关键词】关键词 CAV1；HL-60；慢病毒；细胞增殖；细胞凋亡 ·论著·
急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia, AML)是造血干细胞异常克隆增生导致的一种恶性肿瘤性疾病。近年来AML的治疗虽然取得了长足的进步，
但仍有20%以上的白血病患者难以完全缓解，最终复发、死亡。Caveolae是细胞膜上直径为50-100 nm烧瓶状的囊泡结构，参与细胞的胞吞、胞饮、胆固醇转运，可充当离子膜传感器、保护器和组织导体等[1]。Caveolin-1(CAV1)是caveolae的主要结构蛋白，分子量为22 kD,其基因位于人染色体7q31.1。平板状的脂筏与CAV1结合后便会凹陷，其脚手架区(caveolin scaffolding domin, CSD)能与多种信号蛋白结合，处于各条信号通路交联中心位置[2]。 CAV1在肿瘤中具有不同的作用机制，可与多种信号通路(如MAPK[3]、PI3K/AKT[4]、MEK/ERK[5]、RAS[6]、STAT3[7])对肿瘤起到调控的作用。在不同的白血病肿瘤细胞中，CAV1表达情况亦不同。在成人T淋巴细胞白血病中CAV1呈现过表达现象[8],我们的前期基础研究[9]结果表明，在HL-60细胞中CAV1呈低表达状态，齐墩果酸(Oleanolic acid, OA)作用于HL-60细胞能够抑制PI3K/AKT信号通路，上调CAV1基因的表达，抑制HL-60细胞增殖活性、促进其凋亡。为了探讨CAV1在HL-60细胞中所起的作用，证实CAV1是否参与调控细胞的增殖与凋亡过程，设计本实验内容。研究对象选用HL-60细胞株，构建慢病毒重组表达载体pcDNA-EF1-CAV1,以慢病毒为介导使CAV1整合到HL-60细胞基因组中，使其过表达。本研究将进一步探讨CAV1在AML中的作用机制、确定白血病发生的直接相关靶基因、为研发新型药物提供理论依据。
材料和方法
主要材料
HL-60细胞购自中国科学院上海生命科学院细胞库；293NT细胞、表达载体pcDNA-EF1-GFP及慢病毒实验包装系统均购自美国System Biosciences公
司；TRIzol、RPMI 1640细胞培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Invitrogen公司；限制性内切酶XbaI、BamHI、T4 Ligase、DH5α、荧光定量RT-PCR试剂盒、反转录试剂盒均购自日本TaKaRa公司；蛋白提取试剂、蛋白定量试剂盒及ECL发光试剂盒均购自美国Pierce Biotechnology公司，PVDF膜购自美国Millipore公司；抗CAV1抗体购自美国Santa Cruz公司；抗兔HRP-IgG二抗购自美国CST公司；CCK-8试剂盒购自日本同人化学公司；凋亡试剂盒购自美国Becton Dickinson公司。 细胞株及培养
HL-60细胞使用含10% FBS的RPMI-1640培养液培养；293TN细胞使用含10% FBS的DMEM培养。培养条件均为37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱。HL-60细胞呈悬浮生长，293TN细胞为贴壁生长。细胞接种密度为每毫升1×105个，每2-3 d传代1次。 目的基因CAV1的PCR扩增
分离新鲜人血白细胞，离心、洗涤并收集1×106个细胞。加入1 ml TRIzol,反复吹打后12000×g，4℃离心5 min，将上清转移至经DEPC水处理过的干净1.5 ml无菌离心管中进行总RNA的抽提。用紫外分光光度计测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。用逆转录酶Reverse Transcriptase M-MLV进行逆转录合成cDNA。根据NCBI数据库人CAV1基因信息(NM_111753.4)以及pcDNA-EF1-GFP载体序列，使用Oligo 6.6引物设计软件设计带有酶切位点的引物，上游引物：5′-GCTCTAGAGCCAGGTAGTCTGGGGGCAAATAC-3′ , 下游引物：5′-CGGGATCCTTATATTTCTTTCTGCAAG-3′。引物合成为Page级纯化，2OD合成量，扩增长度为559 bp。扩增体系50 μl,其中Ex
慢病毒介导的CAV1过表达对HL-60细胞增殖与凋亡的影响
