电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注大鼠凋亡相关因子
Bcl-2和Bax表达的影响*
张亚敏，孙 华△，徐 虹，陈素辉，司英奎
【摘 要】目的：观察电针百会、足三里穴对脑缺血大鼠Bcl-2和Bax表达的影响，从细胞凋亡的角度探讨电针治疗该病的机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，根据再灌注时间又分为24 h和72 h组。假手术组：仅分离血管，不插入线栓，固定在布袋20 min，不进行电针治疗。模型组：制作脑缺血再灌注模型，每日固定同假手术组。电针组：电针百会穴和左侧足三里穴，日1次，留针20 min。规定时间点取大鼠脑组织，以免疫蛋白印记法及实时荧光定量PCR法检测缺血脑组织Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达。结果：电针组Bcl-2蛋白及mRNA表达显著高于同一时间点的模型组(P<0.05)，Bax蛋白及mRNA表达显著低于同一时间点的模型组(P<0.05)。结论:电针大鼠百会、足三里穴能上调Bcl-2蛋白及基因表达水平，下调Bax蛋白及基因水平，电针减轻缺血再灌注后脑损伤，可能与上述调节相关。 【期刊名称】针灸临床杂志 【年(卷),期】2017(033)002 【总页数】4
【关键词】电针；大脑动脉栓塞；脑缺血再灌注；凋亡
缺血性脑卒中因其高发病率、高致残率和致死率严重威胁人们的健康，尽快恢复缺血区血流是有效的治疗手段，矛盾的是，恢复血流灌注后，损伤有可能进一步加重，称为脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)。前期研究发现[1-2]，电针CIRI大鼠百会、足三里穴能减轻大鼠缺血性
脑损伤，其机制尚不明确。细胞凋亡是CIRI病理过程的重要因素，其中Bcl-2家族在调控内源性凋亡途径中起到重要作用，抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax协同作用参与凋亡调控过程[3]，电针百会、足三里穴是否能通过干预Bcl-2及Bax的表达干预细胞凋亡过程尚不明确。本研究以局灶性CIRI大鼠为研究对象，探讨电针百会、足三里穴对CIRI大鼠凋亡相关Bcl-2、Bax 蛋白及mRNA表达的影响，从分子及基因水平探讨电针治疗脑缺血的机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组
选用雄性健康SD大鼠36只,饲养于北京协和医院SPF级屏障环境，动物由实验动物中心提供，许可证号SCXK(京)2012-0001，体质量在230～270 g，实验操作依据北京协和医院实验动物指南。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组和电针组，根据再灌注时间又分为24 h和72 h组，各组每个时间点6只大鼠。 1.2 实验试剂与仪器
主要试剂：水合氯醛(国药集团化学试剂北京有限公司，货号30037527)，兔抗大鼠Bcl-2抗体(美国Santa Cruz Biotechnology，货号sc-492)，兔抗大鼠Bax抗体(美国Cell Signaling Technology，货号CST 3183s)，RNA提取试剂盒(美国Omega，货号R6812)，反转录试剂盒(美国Promega，货号M5301)。主要仪器与耗材：尼龙线栓(北京沙东生物技术公司，货号2636-4A)，长城牌全能脉冲电疗仪(杭州丹顿医疗器械有限公司，货号KWD-808)，PVDF膜(美国Millipore，货号IPVH00010)，紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司，货号UV-2000)，荧光定量PCR仪(美国Bio-rad，货号
CFX96)。
1.3 脑缺血再灌注模型制备与各组处理
根据Longa等线栓法[4]及前期实验改良的方法[5-6]制备脑梗死模型，大鼠术前12 h禁食禁水，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)，仰卧固定于手术台，颈部手术区消毒后行正中切口，钝性分离颈部肌肉和结缔组织，充分分离右侧颈总、颈内及颈外动脉。结扎颈外动脉远心端及颈总动脉分出处，显微剪剪小口插入线栓，松开颈外动脉分出处的结扎线，使线栓进入颈总动脉，调整方向沿颈内动脉至大脑中动脉入口至完全闭塞，线栓插入长度约为(18±0.5)mm，固定线栓后缝合皮肤，将大鼠放回笼内。2 h后拔出线栓实现再灌注，大鼠清醒后以Bederson 5级评分法[7]评估其神经功能缺损，1～3分纳入实验。
假手术组:仅分离各动脉但不插入线栓，每日布袋固定20 min。模型组:制作CIRI模型，每日固定同假手术组。电针组：造模成功后，将大鼠装入特制的布袋中固定，露出头部和左下肢，选用百会穴和左侧足三里穴，采用0.5 mm×25 mm毫针刺入约10 mm，接电针仪，采用疏密波(频率2 Hz、强度约2 mA)，留针20 min，1次/天。 1.4 组织取样及检测
各组在规定时间点麻醉后断头取脑，冰上分离缺血区脑组织置于冻存管内，液氮冻存备用。
Western blot法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达：取冻存脑组织，PIPA悬浮脑组织，高速组织匀浆机匀浆(每250 mg组织加1 ml裂解液)，4℃离心12000 rpm×15 min，取上清，BCA法测蛋白含量，配12%、4%的聚丙烯酰胺凝胶，
电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注大鼠凋亡相关因子Bcl-2和Bax表达的影响
