西尼罗河病毒的检测多重PCR连接酶检测反应检测发展

西尼罗河病毒的检测多重PCR，连接酶检测反应检

测发展

西尼罗河病毒（WNV）首次在乌干达的病人于1937年分离（32），已经成为日本脑炎病毒（乙脑）的最广泛的成员（2）。它在1999年在西半球的首次出现，在纽约市（10，22，26）报告里西尼罗病毒性脑炎62例，7人死亡。在2000年（36，37），由纽约市健康与心理卫生署发起的蚊子池的监察计划，并献血筛查被引进美国于2003年6月在美国报告23个人中16人毒血症在过去一年（8，33）。由于其进入美国，该病毒已迅速蔓延，目前在41个国家流行和哥伦比亚特区（11）。

西尼罗病毒株，主要属于两个不同的谱系，表现出相当的基因多样性，在临床和环境样本的识别和检测构成了挑战。宗族1包括来自几大洲的菌株，并可以细分成至少有三个分支，分支1A，其中包括来自欧洲，非洲，美国和以色列的菌株分支1B，这是针对从澳大利亚库京株;和分支1C，其中包括2株来自印度。宗族2西尼罗病毒株包括来自非洲撒哈拉以南地区和马达加斯加（6，20）。宗族2株之间遗传距离特别大为（75.7至76.8％），观察宗族1株（95.2至99.9％）（20）。

除了这种固有的多样性，西尼罗病毒和隔离新病毒株的各种谱系的蔓延正在不断认可。一个宗族2株在欧洲中部（2），报道最近从欧洲中部和南部俄罗斯的两个新菌株的特点，其遗传距离的基础上，可以考虑西尼罗病毒是独立的谱系（谱系3和4）或乙脑组新成员（1）。此外，北美菌株的系统发育分析表明在纽约原型基因组突变WN-NY99积累应变导致新的遗传变异（5，13，20）。

蚊子池和筛选的血液供应主要由反转录（RT）-PCR为基础的核酸扩增检测（NAT）的方法（31，33）。尽管基因的多样性，最近水平的研究表明，低于40％的参加实验室检测宗族2株（28）。分子检测方法是敏感的，还能够检测出两个谱系，以及众多西尼罗病毒的新兴株特征的病毒，是必要的（34）。

在这份报告中，我们描述了一个新的发展，都基于多重RT-PCR和连接酶检测反应（LDR）的谱系（图1）。LDR最初是为受歧视的单碱基突变或多态性（3，4）。该技术已被用于检测癌基因突变和单核苷酸多态性（14-16，18，19）以及最近的探测和识别细菌在临床血液样本（29）。

我们描述了西尼罗病毒蚊子池样品，临床分离株，以及国家和国际，株检测和鉴定技术的验证。高灵敏度和广泛覆盖的多重RT-PCR/LDR法可以使西尼罗河病毒的血清诊断得到有价值的补充，尤其是在早期症状的患者。此外，该技术的复用能力使得它适合于发展为一个更全面的病毒原体检测。

材料与方法

病毒：在这项研究中所用的西尼罗病毒株来自乌干达，法国，以色列，纽约（NY99）（见表1）属于欧洲诊断网络进口的病毒和由M.Niedrig在罗伯特·科赫研究所提供的，柏林，德国（28）。所有其他菌株由从来自世界新出现的病毒和虫媒病毒在得克萨斯医学科大学加尔维斯顿（7）中心获得。

灵敏度测试，西尼罗病毒负载面板添加NY99病毒定义稀释血浆样本，请提供由R.兰乔蒂中心疾病控制与预防中心（CDC）在柯林斯堡部媒介传播的传染病，一氧化碳（21）。面板滴度为0.15 PFU/ ml的（量化标准斑块检测180,000）。从各种渠道获得用于其他黄病毒的特异性确定。圣路易斯脑炎，墨累河谷热，Powassan脑炎，黄热病病毒，获得R.兰乔蒂（CDC堡柯林斯）；乙脑和森林脑炎病毒获得M.Niedrig（罗伯特·科赫研究所，柏林，德国）；从研究区和登革热病毒血清型I至IV获得盎司（登革热疾病预防控制中心在波多黎各的圣胡安）（见表2）。

蚊子池和临床标本。获得98个积极和20消极的蚊子池样品，从纽约市健康与心理卫生署（纽约DOHMH），西尼罗病毒监测计划（36，37）的一部分，在纽约市的不同地区收集和测试抓来的蚊子。

从50 NAT阳性献血者和92的NAT负捐助者的血浆样品进行了测试。休斯敦，得克萨斯州墨西哥湾沿岸地区血液中心提供的阳性血浆样本；从CDC登革热分