石蜡切片和HE染色详细步骤
石蜡切片和HE染色 方法与步骤 1(取材
颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织(或其他组织)。切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2,3mm厚。
注意事项:
(1)取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 (2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 2(固定
将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30,50min。
注意事项:
(1)一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
(3)固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
(4)材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
3. 脱水
50%酒精?70%酒精?80%酒精?95%酒精?100%酒精?100%酒精。每级0.5h。 注意事项:
(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。
(2)在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
(3)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
(4)在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。 (5)如需过夜，应停留在70%酒精中。
(6)脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 4. 透明
1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) ?纯二甲苯(1.5h) ?纯二甲苯(1.5h)。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
注意事项
(1)使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。
(2)更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 3)在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱(
水，然后再透明。 5. 浸蜡
将处理的材料置于1/2石蜡+1/2二甲苯中，40?烘箱40min。再放入石蜡?30min、石蜡?40min。 透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等)，使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55-60?左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h。
注意事项
(1)尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度; (2)透蜡温度要恒定，不可忽高忽低;
(3)操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。 6. 包埋
先提升恒温箱的温度至60?，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60?的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签(正面向外置于底部)，补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 7. 切片
?将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。 ?将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。
?摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。
?调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。 ?调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。
?一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min。
?切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。
?用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。 ?切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。 8. 粘片
将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30,40?中过夜。
10. 脱蜡和染色
纯二甲苯(10-20min)?纯二甲苯(5-10min)，1/2 二甲苯十1/2纯酒精?100%酒精?95,酒精?85,酒精?70,酒精?50,酒精?自来水冲洗10s?切片放入苏木精中染色约10-30min ?用自来水流水冲洗约15min使切片颜色变蓝。
11. 分化和漂洗
将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约2秒至数十秒钟。见切片变红，颜色较浅即可。切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。
12. 脱水?和复染
切片入50%乙醇?70%乙醇?80%乙醇中各3-5min。用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。
伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。
13. 脱水?和透明
将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇，将切片放入二甲苯?、?中各3-5min。
二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。
14. 封藏
中性树胶封存，因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠
度。
石蜡切片和HE染色详细步骤
