热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，Tail-PCR技术）
Sep 04, 2007No Comments
在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近
的未知序列。虽然人们很早就采用随机引物的PCR，但由于无法有效地控制随机引物引发的非特异产物的产生，所以一直未能广泛应用。近年有华南农业大学刘耀光教授设计的TAIL-PCR，又叫热不对称交错PCR，能够较好地解决上述难题。
该技术通过3个嵌套的特异性引物(specialprimer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp)分别和一个低Tm值的简并引物（Arbitrarydegenerate prime，AD，约14bp)）组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。
在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成： ①由特异性引物和简并引物扩增出的产物； ②由同一特异性引物扩增出的产物； ③由同一简并引物扩增出的产物。
在TAIL-PCR反应中，其中后2种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。
TAIL-PCR技术简单易行，反应高效灵敏，产物的特异性高，重复性好，能够在较短的时间
内获得目标片段，已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列，从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。 第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸， 增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物：特异性产物①型和非特异性产物（②型和③型）。
第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，
使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。
第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循
环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。
Tail-PCR的技术优点及技术难点。 Tail-PCR技术的优点：
1）简单。只要设计好引物，即可以用基因组DNA作模板直接筛选到目标序列，节省了PCR反应前后的许多费时，费力的操作程序。
2）特异性高。用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相组合，通过不对称的温度循环和分级反应，使反应体系有利于特异引物的扩增，最终的扩增产物中目的片段占绝对优势，反应产物可以直接用作探针标记和测序模板。
3）高效灵敏。使用任何一个简并引物，在60％-80％的反应中能够产生特异性产物。 4）快速。整个Tail-PCR反应循环能够在1天内完成，可以快速地获得目标片段。 5）不涉及连接反应，反应产物准确可靠，重复性好。
但是，Tail-PCR反应需要较多的引物组合，并且由于简并引物存在有限的结合位点，对于个
别的侧翼序列，即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果。整个Tail-PCR需要一系列连续的反应，反应条件的设置要求比较精细。
热不对称交错PCR(TAIL-PCR)
