质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定

实验题目 质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定

实验目的 掌握质粒提取的原理与各种试剂的作用和琼脂糖凝胶电泳原理和操作

实验原理 质粒存在于细菌，线粒体等，独立于染色体之外，能够稳定遗传并自我复制，是一个双链环装DNA。对数期大肠埃希菌含有质粒。溶液一可使细菌充分重悬，溶液二使细菌裂解，释放质粒和基因组DNA.溶液三起到中和作用，使得质粒DNA迅速复性，而基因组DNA因为分子巨大，复性时间长。离心后，质粒DNA留在上清液，而基因组DNA和细胞碎片沉淀在离心管。

琼脂糖凝胶电泳 蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此泳动的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50bp的DNA。此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可以确定DNA在凝胶中的位置。 实验主要步骤 质粒DNA提取

1. 取4ml细菌平均分两份加入离心管，以12000r/min离心1min，去除上清液 2. 加100ul用冰预冷溶液I，移液枪打散细菌沉淀使其成为悬浮液

3. 加入200ul溶液II，盖紧盖口，翻转五次，充分混合，避免振荡，置于冰上

4. 加入150ul冰预冷溶液III，盖紧盖口，翻转离心管5次，温和摇匀直到粘稠的细菌裂解物出现，放于冰上5min

5. 离心管以12000r/min离心5min

6. 取上清液加入等量的酚：氯仿混合液，轻轻摇匀，以12000r/min离心7min

7. 取上清液加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻摇匀，12000r/min离心5min，去除上清液，倒置在滤纸上干燥

8. 用1ml70%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min 9. 用50ul无菌水溶解质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳：

1.制胶。将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化,混匀,冷却至55°℃,加入EB染料,倒入已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳。

2.加入10ul的6×加样缓冲液到DNA样品,混匀,然后用移液枪取50u1样品加入样品孔中。(不要漫出加样孔)

3.接通电极,在120V电压下进行电泳20min-30min

4.当加样缓冲液中的溴酚兰迁移至足够分离DNA片段的距离时,关闭电源。 5.已染色的凝胶可以直接在紫外透射仪上观察或照相。

实验结果

本组点样照片显示各种杂质去除得较为彻底，得到了较高纯度的超螺旋状态的质粒DNA。

实验讨论 要获得高纯度的质粒DNA，必须彻底去除蛋白质、染色体DNA和RNA。在 整个质粒提取过程中出去染色体DNA的关键步骤是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时间。实验过程应避免剧烈震荡，造成DNA断裂。