第3课时 导入、检测和鉴定目的基因
[学习导航] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。 [重难点击] 1.目的基因导入受体细胞的方法。2.检测和鉴定目的基因的方法。
方式一 通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取及基因表达载体的构建。 在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。 由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。
方式二 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
一、导入目的基因
将目的基因导入受体细胞的方法和过程 受体细胞 常用方法 植物细胞 农杆菌转化法 将目的基因插入Ti质粒的T过程 －DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 动物细胞 显微注射法 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 2＋微生物细胞 感受态细胞法 Ca处理细胞→感受态细胞→重组的基因表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
1．农杆菌转化法的分析
(1)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
答案 基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。
(2)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上？
答案 农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。
2．植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？ 答案 植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。
3．为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？
答案 微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。
2＋
1．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。如图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：
(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T－DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到_______(部位)即可。
(2)根据T－DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制______________________酶合成的基因。
(3)图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是__________类化合物。
(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取____________________________(至少写出两种)。
答案 (1)单子叶植物 将目的基因导入植物细胞 染色体的DNA T－DNA片段(内部) (2)DNA连接酶、限制 (3)酚 (4)基因枪法、花粉管通道法
解析 (1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T－DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。(2)根据T－DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。 一题多变 判断正误：
(1)获得上述转基因植物的核心步骤是a( )
(2)用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，从而把目的基因导入植物细胞，在这个过程中所有细胞都导入了目的基因( ) (3)在过程a中只需要DNA连接酶参与( )
(4)用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，要经过植物组织培养才能获得表现出新性状的植物( )
(5)因病毒能够侵染正常细胞，有的病毒还能将自己的核酸整合到宿主细胞的染色体上，所以动植物病毒也可作为基因工程的载体( ) 答案 (1)√ (2)× (3)× (4)√ (5)√
易错点拨 农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 2．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是( ) A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济和有效 B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变 D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法 答案 A
解析 不同受体细胞导入目的基因的方法不同，每种方法都有利弊。目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济和有效；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法；目的基因导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化。
二、检测和鉴定目的基因
目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。
1．DNA水平检测：采用 DNA分子杂交法。主要做法是用放射性同位素标记的已知DNA片段作基因探针检测受体细胞。如果能发生特异性结合，说明目的基因已经插入转基因生物染色体的DNA中。
2．RNA水平检测：采用分子杂交技术。用已标记的目的基因作为探针与待测生物体内提取的mRNA分子杂交，观察是否出现杂交带。
3．蛋白质水平检测：采用抗原—抗体杂交法。从待测转基因生物中提取蛋白质， 用相应的抗体进行杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已经表达了。 4．个体水平检测：对个体的生物学特定性状进行检测。
1．观察目的基因的检测示意图(如上图所示)，回答下列问题：
(1)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，采用DNA分子杂交技术。这种技术的主要做法是什么？
答案 主要做法是用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，检测受体细胞的DNA中有无目的基因。显示出杂交带，说明目的基因已经插入染色体DNA中。
(2)DNA分子杂交的原理是什么？除了用于目的基因的检测与鉴定以外，试举例说明还有哪些应用？
答案 碱基互补配对原则。还可用于亲子鉴定、刑事侦察、生物亲缘关系确定等。
(3)检测目的基因是否转录出了mRNA，采用分子杂交技术，这种技术与DNA分子杂交技术有何异同？
答案 相同之处是都采用分子杂交技术，不同之处是从转基因生物中提取的是mRNA，同样用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。 (4)检测目的基因是否翻译出蛋白质的方法是什么？其原理是什么？ 答案 抗原—抗体杂交法。原理是抗原能与相应抗体特异性结合。 2．检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？ 答案 用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。 归纳总结 关于不同分子检测的原理、场所、探针的异同
?1?原理：转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物细胞内的mRNA；翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。
?2?场所：不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
?3?探针：在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。
3．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( )
①检测受体细胞的染色体上是否有目的基因 ②检测受体细胞是否有致病基因 ③检测目的基因是否转录出了mRNA ④检测目的基因是否翻译出了蛋白质 A．①②③ C．①③④ 答案 C 4．判断正误
(1)如果检测出标记基因表达的性状，说明载体已导入受体细胞( )
(2)检测目的基因是否翻译成蛋白质是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键( ) (3)DNA探针用来检测目的基因是否导入( )
(4)鉴定转化的基因是否成功表达，在分子水平上可应用的方法是抗原—抗体杂交( ) 答案 (1)√ (2)× (3)× (4)√
题后归纳 目的基因的检测与鉴定的方法汇总
B．②③④ D．①②④
2017-2018学年高中生物第一章基因工程第一节基因工程概述-导入检测和鉴定目的基因同步备课教学案
