α多肽链具有转录酶活性5`-3`（聚合活性）和RNaseH活性。RNaseH活性是由α多肽链经蛋白酶水解切割后产生的一种多肽片段，它以5`-3`或 3`-5`的方向特异的降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链；
β多肽链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5`-3`脱氧核酸外切酶活性 它的5`－3`方向的聚合活性，取决于有一段引物和一条模板分子的存在，它可以用mRNA为模板。以用mRNA为模板合成cDNA，是反转录酶的最主要用途。 也可以用单链DNA或RNA作模板合成供实验用的分子探针。 图1：以RNA为模板聚合互补DNA
图2：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
五、 T7 DNA聚合酶
它是从感染了T7噬菌体的大肠肝菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。
T7DNA聚合酶是按两种亚基形式纯化出来的:
其中基因5蛋白质本身是一种非加工的DNA聚合酶，具有单链的3`-5`核酸外切酶活性。 其二，硫氧还蛋白，作为一种辅助蛋白，增加基因5蛋白质同引物模板的亲和性，使DNA的加工合成达数千个核苷酸。
此外，T7DNA聚合酶还具有很高的单链及双链的3`-5`核酸外切酶活性。
T7 DNA聚合酶的用途
大分子量模板上引物开始的DNA延伸合成。合成中，不受DNA二级结构的影响。 同T4 DNA聚合酶一样，T7DNA聚合酶通过单纯的延伸或取代合成标记DNA的3`-末端。
T7DNA聚合酶和T4DNA聚合酶一样，将双链DNA的3`和5`突出末端，转变成平末端的结构。
§2.4 核酸酶
一、核酸外切酶：一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。 分为单链核酸外切酶和双链核酸外切酶 单链核酸外切酶：
大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ（exoⅠ） 大肠杆菌核酸外切酶（exoⅦ） 双链核酸外切酶：
大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ ） λ噬菌体核酸外切酶（ λ exo ）
大肠杆菌核酸外切酶（exoⅦ）
它能够从5′-末端或3′-末端降解DNA分子，产生出寡核苷酸短片段。是一种不需要Mg2+离子的核酸酶 （图）
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大肠杆菌核酸外切酶（exoⅢ
核酸外切酶Ⅲ的主要活性是，按3′→5′的方向催化双链DNA自3′-OH末端释放5′-单核苷酸 （图）
λ噬菌体核酸外切酶（ λ exo ）（图）
λ核酸外切酶最初是从感染了λ噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子自5′-P末端进行逐步的加工和水解，释放出5′单核苷酸，但它不能降解5′-OH末端
λ核酸外切酶的用途有两个方面：第一，将双链DNA转变成单链的DNA，供按双脱氧法进行DNA序列分析使用；第二，从双链DNA中移去5′突出末端，以便用末端转移酶进行加尾。
二、核酸内切酶
1. S1核酸酶
来自从稻谷曲霉，是一种高度单链特异的核酸内切酶，它降解单链DNA的速率要比双链DNA快75000倍，酶活性的表现需要Zn2＋，最适PH为4.0-4.3。 （1）主要功能：
催化RNA和单链DNA分子降解成5`单核苷酸，
作用于双链DNA分子的单链区，而且这种单链区可以小到只有一个碱基对。 图1：内切单链DNA或RNA
图2：内切带切口的或缺口的双链DNA或RNA
（2）主要用途：
测定杂种核酸分子（DNA-DNA或RNA-DNA）的杂交程度。
给RNA分子定位。
测定真核基因中间隔子序列的位置，探测双螺旋的DNA区域。
从限制酶产生的黏性末端中移去单链突出序列。
打开在双链cDNA合成期间形成的发夹结构等实验操作。
RNA分子定位（图）
一个RNA分子是由其模板DNA中的400－1400之间的核苷酸序列编码的。这条RNA分子同包含核苷酸400－1400的DNA编码链杂交，然后再用S1核酸酶处理，那么RNA－DNA杂种分子中的单链尾巴会被降解掉，形成一条长度为1000bp的平末端的RNA－DNA杂种分子，回收这种分子，便可以测定出这段抗S1核酸酶的DNA片段长度。如果所用的这段DNA是放射性标记的，其长度可用凝胶放射自显影测定。
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2. Bal31核酸酶
来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）
具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。
当底物是双链环形DNA，Bal31的单链特异的核酸内切酶活性，通过对单链缺口或瞬时单链区的降解，将超盘旋的DNA切割成开环DNA，进而成为线性双链DNA
当底物是线性双链DNA分子时Bal31双链特异的核酸外切酶活性，会从5`和3`两末端移去核苷酸。（图）
Bal31核酸酶的活性需要Ca2＋和Mg2+。
它是分子克隆中十分有价值的工具酶，其主要用途有： 诱发DNA发生缺失突变；
定位测定DNA片段中限制位点的分布； 研究超盘旋DNA分子的二级结构，并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构。
诱发DNA发生缺失突变（图）
定位测定DNA片段中限制位点的分布
先用Bal31核酸酶处理待测的线性DNA片段，使之以渐进的速度从5`和3`两末端同时降解DNA，并在不同的时间间隔加入EGTA，终止Bal31核酸酶的消化作用，然后用苯酚抽提样品，再加入我们期望使用的核酸内切限制酶进行在消化。如此按不同时间取样的DNA消化样品，同只用核酸内切限制酶消化的对照组DNA样品，一道进行凝胶电泳分析。DNA片段从凝胶中消失的先后次序，代表这些片段在DNA分子中的前后排列位置。根据这些结果，便可以把这些DNA片段按正确的顺序排列出来，并确定出有关限制酶的识别位点。
§2.5 核酸修饰酶
一、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）
末端脱氧核苷酸转移酶能够催化5`-脱氧核苷三磷酸进行5`向3`方向的聚合作用，逐个的将脱氧核苷酸分子加到线性分子的3`-OH末端，但是它不需要模板，4种dNTPs都可以作为它的前体。
接受核苷酸聚合的受体DNA，可以是具有3`-OH末端的单链DNA，也可以是具有3`-OH末端的双链DNA
平末端不是末端脱氧核苷酸转移酶的有效底物，但如果用Co2+取代Mg2+离子作为辅助因子，便可以成为它的有效底物。 （图）
末端脱氧核苷酸转移酶的主要用途
分别给外源DNA分子及载体片段加上互补的同聚物尾巴，以使他们可以重组起来。 例如：给载体的线性分子的3`-OH末端加上poly（dG）尾巴，同时给待克隆的外源DNA片段的3`-OH末端加上poly（dC）尾巴，于是这两条DNA分子便可以通过互补尾巴的碱基配对而彼此连接起来，最后再用连接酶将单链缺口封闭起来。 二、碱性磷酸酶
来自小牛肠的碱性磷酸酶（CIP）
来自大来自大肠杆菌的碱性磷酸酶（BAP）
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他们的共同作用是催化核酸分子脱掉5`磷酸基团，从而使DNA片段的5`-P末端转化为5`-OH末端，这就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。
分子克隆中的应用：经碱性磷酸酶处理的质粒线性DNA分子失去了自身环化能力，但仍能与具5?-P和3?-OH的外源DNA片段重组，并在转化到受体细胞后完成Nick的修复工作。
CIP具有明显的优点，它在SDS中加热至68℃就会完全失活；而BAP是热抗性，要终止其作用就很困难；
CIP活性要比BAP高出10～20倍，所以实验中一般使用CIP。
三、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）（图） 基本特性：
用途：
习题练习
1．某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因? 2．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?
3．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列： GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 为什么?
4．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么?
5.DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用？
6..DNA连接酶在什么情况下使用？如何将不同DNA分子末端进行连接？ 7..碱性磷酸酶有什么作用？
8. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？
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第二章_基因工程中常用的工具酶
