α多肽链具有转录酶活性5`-3`(聚合活性)和RNaseH活性。RNaseH活性是由α多肽链经蛋白酶水解切割后产生的一种多肽片段,它以5`-3`或 3`-5`的方向特异的降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链;
β多肽链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5`-3`脱氧核酸外切酶活性 它的5`-3`方向的聚合活性,取决于有一段引物和一条模板分子的存在,它可以用mRNA为模板。以用mRNA为模板合成cDNA,是反转录酶的最主要用途。 也可以用单链DNA或RNA作模板合成供实验用的分子探针。 图1:以RNA为模板聚合互补DNA
图2:双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
五、 T7 DNA聚合酶
它是从感染了T7噬菌体的大肠肝菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。
T7DNA聚合酶是按两种亚基形式纯化出来的:
其中基因5蛋白质本身是一种非加工的DNA聚合酶,具有单链的3`-5`核酸外切酶活性。 其二,硫氧还蛋白,作为一种辅助蛋白,增加基因5蛋白质同引物模板的亲和性,使DNA的加工合成达数千个核苷酸。
此外,T7DNA聚合酶还具有很高的单链及双链的3`-5`核酸外切酶活性。
T7 DNA聚合酶的用途
大分子量模板上引物开始的DNA延伸合成。合成中,不受DNA二级结构的影响。 同T4 DNA聚合酶一样,T7DNA聚合酶通过单纯的延伸或取代合成标记DNA的3`-末端。
T7DNA聚合酶和T4DNA聚合酶一样,将双链DNA的3`和5`突出末端,转变成平末端的结构。
§2.4 核酸酶
一、核酸外切酶:一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。 分为单链核酸外切酶和双链核酸外切酶 单链核酸外切酶:
大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ(exoⅠ) 大肠杆菌核酸外切酶(exoⅦ) 双链核酸外切酶:
大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ(exo Ⅲ ) λ噬菌体核酸外切酶( λ exo )
大肠杆菌核酸外切酶(exoⅦ)
它能够从5′-末端或3′-末端降解DNA分子,产生出寡核苷酸短片段。是一种不需要Mg2+离子的核酸酶 (图)
6
大肠杆菌核酸外切酶(exoⅢ
核酸外切酶Ⅲ的主要活性是,按3′→5′的方向催化双链DNA自3′-OH末端释放5′-单核苷酸 (图)
λ噬菌体核酸外切酶( λ exo )(图)
λ核酸外切酶最初是从感染了λ噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子自5′-P末端进行逐步的加工和水解,释放出5′单核苷酸,但它不能降解5′-OH末端
λ核酸外切酶的用途有两个方面:第一,将双链DNA转变成单链的DNA,供按双脱氧法进行DNA序列分析使用;第二,从双链DNA中移去5′突出末端,以便用末端转移酶进行加尾。
二、核酸内切酶
1. S1核酸酶
来自从稻谷曲霉,是一种高度单链特异的核酸内切酶,它降解单链DNA的速率要比双链DNA快75000倍,酶活性的表现需要Zn2+,最适PH为4.0-4.3。 (1)主要功能:
催化RNA和单链DNA分子降解成5`单核苷酸,
作用于双链DNA分子的单链区,而且这种单链区可以小到只有一个碱基对。 图1:内切单链DNA或RNA
图2:内切带切口的或缺口的双链DNA或RNA
(2)主要用途:
测定杂种核酸分子(DNA-DNA或RNA-DNA)的杂交程度。
给RNA分子定位。
测定真核基因中间隔子序列的位置,探测双螺旋的DNA区域。
从限制酶产生的黏性末端中移去单链突出序列。
打开在双链cDNA合成期间形成的发夹结构等实验操作。
RNA分子定位(图)
一个RNA分子是由其模板DNA中的400-1400之间的核苷酸序列编码的。这条RNA分子同包含核苷酸400-1400的DNA编码链杂交,然后再用S1核酸酶处理,那么RNA-DNA杂种分子中的单链尾巴会被降解掉,形成一条长度为1000bp的平末端的RNA-DNA杂种分子,回收这种分子,便可以测定出这段抗S1核酸酶的DNA片段长度。如果所用的这段DNA是放射性标记的,其长度可用凝胶放射自显影测定。
7
2. Bal31核酸酶
来自艾氏交替单胞菌(A.espejiana)
具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。
当底物是双链环形DNA,Bal31的单链特异的核酸内切酶活性,通过对单链缺口或瞬时单链区的降解,将超盘旋的DNA切割成开环DNA,进而成为线性双链DNA
当底物是线性双链DNA分子时Bal31双链特异的核酸外切酶活性,会从5`和3`两末端移去核苷酸。(图)
Bal31核酸酶的活性需要Ca2+和Mg2+。
它是分子克隆中十分有价值的工具酶,其主要用途有: 诱发DNA发生缺失突变;
定位测定DNA片段中限制位点的分布; 研究超盘旋DNA分子的二级结构,并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构。
诱发DNA发生缺失突变(图)
定位测定DNA片段中限制位点的分布
先用Bal31核酸酶处理待测的线性DNA片段,使之以渐进的速度从5`和3`两末端同时降解DNA,并在不同的时间间隔加入EGTA,终止Bal31核酸酶的消化作用,然后用苯酚抽提样品,再加入我们期望使用的核酸内切限制酶进行在消化。如此按不同时间取样的DNA消化样品,同只用核酸内切限制酶消化的对照组DNA样品,一道进行凝胶电泳分析。DNA片段从凝胶中消失的先后次序,代表这些片段在DNA分子中的前后排列位置。根据这些结果,便可以把这些DNA片段按正确的顺序排列出来,并确定出有关限制酶的识别位点。
§2.5 核酸修饰酶
一、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)
末端脱氧核苷酸转移酶能够催化5`-脱氧核苷三磷酸进行5`向3`方向的聚合作用,逐个的将脱氧核苷酸分子加到线性分子的3`-OH末端,但是它不需要模板,4种dNTPs都可以作为它的前体。
接受核苷酸聚合的受体DNA,可以是具有3`-OH末端的单链DNA,也可以是具有3`-OH末端的双链DNA
平末端不是末端脱氧核苷酸转移酶的有效底物,但如果用Co2+取代Mg2+离子作为辅助因子,便可以成为它的有效底物。 (图)
末端脱氧核苷酸转移酶的主要用途
分别给外源DNA分子及载体片段加上互补的同聚物尾巴,以使他们可以重组起来。 例如:给载体的线性分子的3`-OH末端加上poly(dG)尾巴,同时给待克隆的外源DNA片段的3`-OH末端加上poly(dC)尾巴,于是这两条DNA分子便可以通过互补尾巴的碱基配对而彼此连接起来,最后再用连接酶将单链缺口封闭起来。 二、碱性磷酸酶
来自小牛肠的碱性磷酸酶(CIP)
来自大来自大肠杆菌的碱性磷酸酶(BAP)
8
他们的共同作用是催化核酸分子脱掉5`磷酸基团,从而使DNA片段的5`-P末端转化为5`-OH末端,这就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。
分子克隆中的应用:经碱性磷酸酶处理的质粒线性DNA分子失去了自身环化能力,但仍能与具5?-P和3?-OH的外源DNA片段重组,并在转化到受体细胞后完成Nick的修复工作。
CIP具有明显的优点,它在SDS中加热至68℃就会完全失活;而BAP是热抗性,要终止其作用就很困难;
CIP活性要比BAP高出10~20倍,所以实验中一般使用CIP。
三、T4-多核苷酸磷酸激酶(T4-PNP)(图) 基本特性:
用途:
习题练习
1.某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时,出现了星号活性,请分析可能的原因? 2.在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列,该位点的序列可能是什么?
3.下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列: GAATCG,AAATTT, GATATC, ACGGCA? 为什么?
4.当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时,若要进行双酶切,应采取什么措施?为什么?
5.DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用?
6..DNA连接酶在什么情况下使用?如何将不同DNA分子末端进行连接? 7..碱性磷酸酶有什么作用?
8. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用?
9
第二章_基因工程中常用的工具酶
![](/skin/haowen/images/icon_star.png)
![](/skin/haowen/images/icon_star.png)
![](/skin/haowen/images/icon_star.png)
![](/skin/haowen/images/icon_star.png)