第一章 基因工程的分子生物学基础
1、基因工程（遗传工程、基因操作、重组DNA技术等）：细胞外用各种方法产生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。
基因工程诞生的理论基础：①DNA双螺旋模型；②基因是可以转移的；③操作子模型的建立；④遗传密码子的破译。
基因工程的技术基础：①工具酶（DNA连接酶、内切酶、反转录酶）；②PCR技术；③载体技术；基因转移技术。
2、DNA复制：①两条互补的反向平行的DNA单链之间由众多氢键连接（G-C、A-T）形成稳定DNA双链分子；②DNA合成的起始需要引物提供3，羟基，DNA聚合酶按照5→3方向合成DNA。 3、限制性内切酶：
酶分子 识别位点 切割位点 I类酶 三亚基双功能 二分非对称序列 距识别位点1000bp II类酶 内切酶与甲基化酶分离 III类酶 二亚基双功能 4-8bp序列，回文结构 5-7bp非对称序列 在识别位点中或靠识别位点 分开反应 需要 在识别下游24-26bp 同时竟争 不需要 位点 限制性反应与甲基化反应互斥 限制作用 需要
限制酶剪切：
黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端
结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（①5’突出的黏性末端；② 3’ 突出的黏性末端。）
③平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的DNA片段具有平末端。 产生黏性末端的酶：
a、同尾酶：一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核酸内切限制酶。
b、同裂酶：有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。
4、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成5′，3′磷酸二酯键的酶 ①E. coli DNA 连接酶（只连接粘末端）
利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物。 ②T4 DNA连接酶（粘末端和平末端）
利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类。 在基因工程的实验中主要用T4 DNA连接酶。
5、核酸的分离纯化：通过各种方法将生物材料破碎，释放DNA（RNA）至溶液中，去除杂质（如用苯酚萃取蛋白质），再用乙醇沉淀核酸，通过离心，分离纯化核酸，最后用低浓度盐溶液溶解核酸。
细菌DNA的提取：细菌培养物的生长和收集→细胞提取物的制备→从细胞提取物中纯化DNA→DNA取样的浓缩→DNA浓度的测量 （A260/A280=1.8）。 凝胶电泳：（弱碱性条件）根据DNA或RNA 分子的大小，形状和拓扑结构，将DNA和RNA进行分离的技术。
6、链终止法测序，技术路线与要求：
制备单链模板→将单链模板与一小段引物退火→加入DNA多聚酶，4种脱氧核苷酸，分别加入少量4种双脱氧核苷酸→将4种反应产物分别在4条泳道电泳→根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列。 7、Southern印迹（DNA印迹）：
(1) 提取组织中的DNA，并用内切酶消化，进行琼脂糖凝胶电泳； (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上； (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点；
(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针； (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置，以及信号的强度。 应用：限制性片段长度多态性；确定基因组中基因的拷贝数。 Northern(RNA)印迹：检测基因的表达。
Western (蛋白质)印迹：把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。（蛋白表达量的检测，组织特异性蛋白定位的检测等）
8、实验：鉴定特定基因转录物的转录起点：
（通过核酸酶处理来研究DNA-RNA（RNA-RNA）杂交物）
a、确定转录起始的位置（首先将可能的包含转录起始点以及上游的DNA克隆进入载体，获得单链的DNA片段；加入转录物，进行温育，退火，杂交；用S1核酸酶降解单链部分，获得RNA-DNA杂合双链；通过碱变性，降解RNA；检测被RNA保护的DNA片段的长度；判断所克隆的DNA片段中转录起始点的位置。）
基因工程原理(徐晋麟) 课件归纳总结要点
