以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立研究

以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立研究*

胡文坛1，王婷婷1，张世杰1，何 鑫2，张靖宇1,刘红春1△

【摘 要】[摘要] 目的 以PRDM1基因启动子为靶点构建双荧光素酶报告基因载体，建立体外药物筛选细胞模型，并对中草药小分子化合物进行筛选。方法 将人PRDM1基因启动子序列(267、1 257 bp)克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中，构建重组质粒pGL3-PRDM1并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞，通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映PRDM1基因启动子的启动转录活性，并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化，相关药物处理进行验证。结果 成功构建了荧光素酶报告载体pGL3-PRDM1。用0.5、1、2、4 μmol/L的5-Aza-CdR处理重组的U266细胞筛选模型，与0 μmol/L 5-Aza-CdR相比，增加5-Aza-CdR 的刺激，荧光强度及PRDM1基因启动子的活性呈剂量依赖性增强。与0 μmol/L相比，青蒿琥酯从5 μmol/L浓度开始对PRDM1基因启动子活性呈明显降低(P<0.05)，在20 μmol/L浓度时降到最低；白芍总苷呈现小剂量促进PRDM1启动子活性，高剂量抑制PRDM1基因启动子活性。青蒿琥酯对细胞生长增殖影响较小，白芍总苷对细胞生长增殖的影响较复杂。结论 成功建立了以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型，并筛选出青蒿琥酯能抑制PRDM1基因启动子活性。 【期刊名称】重庆医学 【年(卷),期】2017(046)011 【总页数】5

【关键词】[关键词] PRDM1基因；双荧光素酶报告基因；中草药；药物筛选 ·论 著·

B淋巴细胞诱导成熟蛋白(B lymphocyte induced maturation protein,Blimp)-1,称为正向调节结构域锌指蛋白(positive regulatory domain zinc finger protein,PRDM)1,由PRDM1基因编码,具有5个锌指结构。Morgan等[1]研究结果证实，Blimp-1基因存在不同的转录起始位点和亚型，并于外显子1上游70 kb处存在1个附加外显子,使其具有2种亚型：Blimp-1α和-1β，分别由PRDM1α和PRDM1β编码，前者在调节浆细胞分化发挥重要的转录因子作用，后者由于功能缺陷失去了对多个靶基因的调控作用，所以传统意义上所说的Blimp-1蛋白是指Blimp-1α[2] 。在B细胞系，PRDM1基因表达的Blimp-1特异地表达于所有抗体分泌细胞，包括浆细胞和浆母细胞[3]，是维持骨髓中长寿浆细胞形成及Ig分泌所必需的转录因子，是长期维持抗原特异免疫反应所必需。正常情况下，Blimp-1参与机体内免疫应答的形成并维持稳定状态，但Blimp-1表达或调控异常时，将使免疫功能紊乱，多克隆B细胞激活、多种自身抗体大量产生，诱发系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)、多发性硬化、肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫血等疾病，而干扰Blimp-1表达会使相关自身抗体水平降低，抑制B细胞向浆细胞分化，病情得到缓解，发病延缓[4-5]。本实验旨在通过建立以PRDM1基因启动子为靶点的高通量药物筛选模型寻求Blimp-1表达下调剂，在分离提取的中草药免疫活性成分中进行筛选。包括多糖类、皂苷类、类黄酮类、有机酸类、多酚类和萜类等多种成分被证明能调节机体免疫功能作用，在免疫相关疾病的治疗上也收到较好的临床疗效[6]。 根据相关文献报道，选取PRDM1基因转录起始位点上游267 bp和1 257 bp序列作为本模型的目标启动子序列，再结合双荧光素酶报告基因技术，构建Blimp-1活性抑制剂细胞筛选模型，双荧光素酶报告基因检测系统是目前

从分子水平用于研究分析基因转录调控的有效工具,与RT-PCR相比更快速、灵敏、简便、适用于高通量筛选等优点。Mundy等[7]将含小鼠BMP-2启动子的荧光素酶报告基因质粒转入小鼠成骨细胞系，对3万多种化合物进行筛选，发现洛代他汀可增加报告基因活性，从而寻求到可刺激骨形成的新药物。国内外目前基于该方法构建以PRDM1/Blimp-1基因为靶点的免疫抑制药物筛选模型的报道尚少见。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 293T人胚肾上皮细胞，U266、ARH77人多发性骨髓瘤细胞由本实验室保存。限制性内切酶NheⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、T4 DNA连接酶购自Toyobo公司；质粒回收试剂盒、DNA片段回收试剂盒和MTT细胞增殖试剂盒购自上海生工生物工程公司，LipoFiterTM脂质体转染试剂购自汉恒生物科技公司。胎牛血清购自浙江天杭生物公司，PRMI1640、DMEM高糖培养基购自Hyclone公司。 荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic、pRL-TK和pGL3-Control，Dual-Luciferase Raporter Assay System购于美国Promega公司。凝胶成像系统、基因扩增仪等。 1.2 方法

1.2.1 PRDM1基因启动子片段的克隆及重组载体的构建 按Ezup柱式法从培养的293T细胞中提取基因组DNA,并检测核酸浓度及纯度。根据GeneBank(Gene ID:639)中人类PRDM1基因序列设计引物，并在引物的上游和下游分别加入NheⅠ、HindⅢ及KpnⅠ、XhoⅠ酶切位点。合成PRDM1基因的267 bp启动子和1 257 bp启动子，其中267 bp启动子的上游引物：5′-CGG CTA GCG CTA GCA ATC TGG GGG AAA G-3′；下游引物：5′-CCA