菌种管理规程
目 的
规范药品微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种
的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
范 围
本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、验收、保存、传代、
使用及销毁等。 责 任
? 质量控制处主管：负责菌种的申购。
? 微生物检验人员：负责菌种的验收、保存、传代、使用及销毁等。 ? 质量控制处经理：负责菌种申购计划的审核及日常督促检查。 ? 质量管理负责人：菌种申购计划的审核。 ? 制造中心总监：菌种申购计划的批准。
相关术语
? 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理
中心提供的冷冻干燥菌。
? 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存
的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
? 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养
后，作为日常工作使用的菌种。
? 菌种的代是指将其接种至新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称
为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
相关文件 无 程 序 1菌种的申购
质量控制处主管根据菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出申购计划，由质量控制处经理、质量管理部负责人审核，制造中心总监批准后，向中国药品生物制品检定所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可
以直接向省（市）药检所购买传代用菌种。购买时，需询问和确定菌种的代数，以便传代时控制代数。同时在运输过程中注意严格按照保存条件要求进行。 2菌种的验收
菌种到达实验室后，由质量控制处微生物检验人员验收，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《菌种接收记录》上，内容包括：名称、数量、编号、代数、来源、接收日期、接收人等，新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。新购进的菌种斜面应在一周内完成传代。
3 菌种的传代：菌种的传代因冻干菌（标准菌种）与传代用菌种而不完全相同。 3.1标准菌种的复苏、确认、传代 3.1.1 标准菌种的复苏步骤如下：
? 把冻干菌种管、灭菌毛细滴管（1ml）、双碟、镊子、营养肉汤培养基
（或其它适宜培养基）数支，移入接种室或超净工作台。
? 将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在
灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将标准菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基），滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。
? 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取
1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基）少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基）内，并根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24～72h（细菌需要 24～48h的培养物，酵母菌需要72h的培养物，形成孢子的微生物则宜保藏孢子）。最后将毛细滴管及菌种管经高温灭菌（121℃，30分钟）。黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7
天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
? 取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至100ml4.4.2项下液体培养基
中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
? 储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。 ? 取出培养物，仔细观察液体培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活
生长，若不浑浊，在将其作为无活菌生长的培养物丢弃以前，细菌应至少培养1周以上，真菌和酵母菌至少应培养2周以上，并在丢弃之前应高温灭活处理（121℃，30分钟）。
3.1.2 标准菌种的确认
? 用无菌接种环取上述培养物接种到营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红
钠培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，然后在30～35℃下培养1～3天（细菌）；23～28℃下培养5天（真菌和酵母菌）。培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。最后
菌种管理规程
