玉米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的筛选

玉米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的

筛选

雷海英1，白凤麟1，段永红2，王志军3*

【摘 要】摘 要:为阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能，采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA，利用SMART 技术反转录合成ds cDNA，构建以pGBKT7 为载体的酵母双杂交 cDNA 文库；依据ZmCEN 基因的CDS序列设计引物，构建重组诱饵载体(pGBKT7-ZmCEN)转化酵母菌株Y2HGold，检测诱饵载体的毒性与自激活能力后，筛选与玉米中心蛋白(ZmCEN)互作的猎物蛋白。将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b (TON1b)再次验证相互作用，并选取互作蛋白TON1b，采用BiFC实验分别构建ZmCEN-pSPYNE 和TON1b-pSPYCE BiFC半分子重组载体，转化拟南芥原生质体，进一步验证它们在细胞内的互作；并利用 Uniprot 和 KEGG 在线网站对互作蛋白进行 gene ontology(GO)注释分析。结果表明：玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×107CFU，文库滴度5.36×108 CFU/mL，符合建库要求。经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能，所筛选的cDNA 文库经测序和 Blast 比对分析以及共转验证，最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。GO 注释显示互作蛋白参与的生物过程有 21 种。BiFC结果显示，蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补，从而产生黄色荧光，进一步证实了两者存在互作关系。酵母双杂交系统cDNA文库的成功构建与筛选，为进一步研究玉米ZmCEN及其与互作蛋白的作用机制奠定了基础。 【期刊名称】西北植物学报

【年(卷),期】2018(038)004 【总页数】9

【关键词】关键词:ZmCEN；SMART 技术；cDNA 文库；酵母双杂交；BiFC；GO 分析

细胞中存在着一个精密的骨架系统——细胞骨架，尤其是微管和微丝骨架，在细胞周期的进程中扮演着重要角色，直接参与有丝分裂中细胞器的组装及胞质分裂，维持细胞正常的形态结构与功能[1]。微管组织中心(microtubule organizing center, MTOC)决定着细胞微管的极性，为微管提供了生长的起点和延伸的方向。哺乳动物的MTOC，如中心体，是一个高度动态变化的结构，随细胞周期进行复制、分离，并且在分裂期形成纺锤体的两极，是细胞的动力中心。而63%的高等植物没有中心体，其功能的执行依赖于细胞内的细胞结合蛋白以及上游信号分子的调控，如中心蛋白(centrin)就是微管组织中心(MTOC)的一种重要组成部分[2]，最早从绿藻(Tetraselmis striata)中分离得到，是负责细胞分裂、分化的重要的钙结合蛋白。现已知中心蛋白存在于藻类、酵母、低等生物及高等动植物中[3-4]。中心蛋白的功能主要是通过与其互作蛋白，如中心体成分Sfi1[5-8]、Mps[9-10] 和Karl[11-12]等作用而执行功能。

目前，中心蛋白的研究主要集中在低等生物、模式植物及人，对玉米中心蛋白(Zea mays L. centrin, ZmCEN)的作用机制及互作蛋白研究未见报道。本实验室在前期研究中已成功进行了ZmCEN基因克隆和表达，并对ZmCEN的功能开展了初步研究[13-14]。本研究通过构建玉米cDNA文库，采用酵母双杂交技术筛选出与ZmCEN互作的蛋白质，为从分子水平上揭示ZmCEN作用的分子机制及开展其生物学功能研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

参试材料为玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’，由山西省农业科学院孙毅研究员提供。

总RNA提取、质粒提取及片段回收等试剂盒购自Takara公司，cDNA文库构建、酵母转化试剂盒、SD/Leu培养基等购自Clontech公司。酵母菌Y2HGold、Y187、大肠杆菌Escherichia coli TOP10均由本实验室保存；酵母双杂交载体质粒为pGBKT7、pGADT7，购自Clontech公司。 1.2 实验方法

1.2.1 玉米幼苗全株cDNA文库的构建 (1) 总RNA的提取：选取玉米在光照培养箱中培养1周的生长健康的4～5叶期植株，连同根部一起取出，冲洗干净，于干热灭菌后的研钵中加入液氮，研磨后利用Trizol(TaKaRa)试剂提取总RNA(具体方法参照说明书)，采用NanoDrop 2000 分光光度计检测RNA浓度和质量。

(2) ZmCEN cDNA 单链、双链合成及双链cDNA的纯化：采用SMART技术和Clontech酵母双杂交文库构建试剂盒(“Mate & Plate” Library System) 合成cDNA，PCR 反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，65 ℃ 6 min(每个循环+5 s)，25 个循环；68 ℃ 5 min。取7 μL反应产物做1% 琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的约93 μL 加入到CHROMA SPIN TE-400纯化柱中纯化，最后溶解到20 μL 去离子水中重悬cDNA，采用1% 琼脂糖凝胶电泳检测质量。 (3) 收集转化子: 将ds cDNA 与 pGADT7-Rec 线性质粒共转至 Y187 感受态细胞中，按酵母转化试剂盒(Yeast makerTM Yeast Transformation System 2，